丁香酚與丁香醛縮二甲醇聯(lián)合抗氧化作用研究

方雪祥,袁慧慧,單艷超,藍(lán)閩波

(華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

丁香酚(2-allyl-4-methoxyphenol,Eugenol)又名子丁香酚,化學(xué)名為2-甲氧基-4-烯丙基苯酚,是植物丁香、丁香羅勒以及樟樹屬肉桂葉揮發(fā)油的主要成分,常溫下為黏稠的淡黃色油狀液體,呈現(xiàn)出特殊辛辣味和強(qiáng)烈的丁香氣息[1]。作為一種天然香料,Eugenol還有很好的抗氧化活性[2-3]。Leopold等[4]發(fā)現(xiàn)Eugenol具有與BHA(丁基羥基茴香醚)幾乎相等的DPPH·自由基清除能力,在檢測羥基自由基清除能力的實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，Eugenol具有極強(qiáng)的金屬螯合能力,大約是同濃度下槲皮素的十倍。因此可以作為一種具有防腐作用、矯味作用和抗氧化作用的食品添加劑[5]、藥物輔料和膳食補(bǔ)充劑。同時,Eugenol可通過降低氧化應(yīng)激水平抑制大鼠腎缺血再灌注性損[6];能提高心肌細(xì)胞超氧化歧化酶(SOD)活性,增強(qiáng)清除超氧自由基陰離子能力,阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng),對H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用[7],其抗氧化[8]、抗炎等藥理活性也越來越受到廣泛關(guān)注。

以課題組前期研究[16-17]為基礎(chǔ),在研究天然抗氧化劑的協(xié)同作用過程中,我們發(fā)現(xiàn)Eugenol和丁香醛(一種香蘭素的衍生物,廣泛的存在于核桃等植物中[18])在甲醇溶液中久置前后的聯(lián)合抗氧化作用有明顯差異,通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)丁香醛與甲醇反應(yīng)的產(chǎn)物-丁香醛縮二甲醇(syringaldehyde dimethylacetal(SGD))和Eugenol產(chǎn)生協(xié)同抗氧化作用。本文通過研究Eugenol和SGD復(fù)配比例對協(xié)同抗氧化效果的影響,初步探討了協(xié)同作用機(jī)制,為發(fā)揮Eugenol優(yōu)異的抗氧化性能,提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Eugenol、α-生育酚、無水甲醇 上海阿拉丁生化科技有限公司;二苯代苦味酰自由基(DPPH·) sigma-aldrich公司;SGD 自制,采用Yukihito等[19]報道的合成方法。

Evolution 220紫外可見分光光度計 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;UHD Accurate Mass Q-TOF高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀、1260 Infinity高效液相色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司;A SH-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司;FA2004電子天平 上海良平儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同抗氧化劑對DPPH·的清除作用 DPPH·清除實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[20]的方法,并在此基礎(chǔ)上根據(jù)實(shí)際需要稍作修改。分別取不同濃度的Eugenol,SGD和α-生育酚供試品溶液2.0 mL與2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH·溶液在PE管中充分混合。α-生育酚作為陽性對照,等量的無水甲醇作為空白對照。將混合溶液放入暗處,常溫反應(yīng)30 min,用紫外分光光度計于517 nm處檢測其吸光度。DPPH·清除率采用公式1計算:

式(1)

其中A1為供試品溶液在517 nm波長處的吸光度,A0為空白甲醇溶液在517 nm處的吸光度,結(jié)果以供試品溶液DPPH·清除率達(dá)到50%時的濃度,即IC50表示。IC50值越小表明樣品的自由基清除能力越強(qiáng)。

1.2.2 Eugenol與SGD對DPPH·的聯(lián)合清除作用 以Eugenol和SGD摩爾比為5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5,配制復(fù)合抗氧化劑,按照1.2.1的方法,測定復(fù)合抗氧化劑的DPPH·清除活性。

1.2.3 協(xié)同作用分析 等效線分析法(Isobologram)被用于協(xié)同抗氧化研究,常用于判斷藥物之間的相互作用,被看作是評價藥物相互作用的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。其中相互作用指數(shù)(λ)可用來判斷相互作用強(qiáng)度,能為抗氧化劑的最佳配比提供理論依據(jù)[21-22]。

式(2)

注:IC50A和IC50B分別表示抗氧化劑A、B單獨(dú)作用時的IC50值,IC50Amix和IC50Bmix分別表示復(fù)合抗氧化劑中A,B的濃度。

如果λ<0.9,表現(xiàn)為協(xié)同作用;λ>1.1,表現(xiàn)為拮抗作用;0.9<λ<1.1則為加和作用。而且λ值越小協(xié)同作用越強(qiáng),λ值越大,拮抗作用也越強(qiáng)[23]。

1.2.4 不同抗氧化劑對DPPH·清除效果隨時間的變化對比 配制12.5 μmol/L和25.0 μmol/L Eugenol甲醇溶液,25.0 μmol/L和50.0 μmol/L SGD的甲醇溶液。取12.5 μmol/L、25.0 μmol/L Eugenol甲醇溶液、25.0 μmol/L SGD的甲醇溶液、復(fù)合抗氧化劑甲醇溶液(含12.5 μmol/L Eugenol和25.0 μmol/L SGD)各2.0 mL分別與2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH·溶液在PE管中充分混合。以等量的無水甲醇作為空白對照。將上述混合溶液放置暗處,常溫反應(yīng)。每隔1 min用紫外分光光度計于517 nm處檢測并記錄溶液的吸光度,直至吸光度值基本不變。

1.2.5 復(fù)合抗氧化劑與DPPH·反應(yīng)產(chǎn)物分析 供試品制備:配制0.25 mmol/L、0.50 mmol/L Eugenol甲醇溶液和0.50 mmol/L、1.00 mmol/L SGD的甲醇溶液,分別取0.25 mmol/L Eugenol甲醇溶液和0.50 mmol/L SGD的甲醇溶液以及復(fù)合氧化劑甲醇溶液(含0.25 mmol/L Eugenol和0.50 mmol/L SGD)各2.0 mL 與2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH·溶液在PE管中充分混合,放置暗處,常溫反應(yīng)30 min,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,用高效液相色譜儀檢測,以Eugenol、SGD和DPPH·三種反應(yīng)物作為對照。分離純化復(fù)合抗氧化劑與DPPH·反應(yīng)的關(guān)鍵產(chǎn)物,用高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀檢測。

高效液相色譜條件:流動相為甲醇(A)和水(B);梯度洗脫條件:0～40 min,40%～100% A;檢測波長:265 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;柱溫:30 ℃。

農(nóng)業(yè)科研活動具有內(nèi)在的特殊性和科技成果的外部性，需要采用適合的評價指標(biāo)體系。評價體系中引入中長期影響因素，為真實(shí)反映出農(nóng)業(yè)科研項(xiàng)目的績效，筆者認(rèn)為評價指標(biāo)中應(yīng)當(dāng)包括成果轉(zhuǎn)化效益指標(biāo)和發(fā)展能力指標(biāo)，以反映中長期影響因素。引入成果轉(zhuǎn)化指標(biāo)旨在促進(jìn)科研與市場對接，激勵農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化，將財政對農(nóng)業(yè)科研經(jīng)費(fèi)的投入轉(zhuǎn)化成農(nóng)業(yè)現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)力的進(jìn)步。引入發(fā)展能力指標(biāo)，主要是把科研單位整體實(shí)力提升納入評價范圍，包括人才培養(yǎng)與流動，條件改善等方面的內(nèi)容，這將有利于引導(dǎo)科研人員更加關(guān)注農(nóng)業(yè)科研項(xiàng)目的長期影響，全面反映農(nóng)業(yè)科研項(xiàng)目的長期效益。

高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀測試條件。色譜條件:流動相為甲醇(A)和水(B);等度洗脫:甲醇/水(50/50),流速為0.2 mL/min;進(jìn)樣體積1 μL;柱溫:30 ℃。質(zhì)譜條件:ESI正離子檢測;離子源350 ℃;干燥氣(N2)流速10 L/min,霧化氣(N2)氣壓45 psi;毛細(xì)管電壓3000 V;一級全掃描(m/z 100～1000)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)平行測定三次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。Statistical Product and Service Solutions 19.0 軟件(IBM)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,檢測實(shí)驗(yàn)測定的IC50值(IC50 mix)與理論的IC50值(IC50add)之間是否具有顯著性差異,如果顯著性差異值P<0.05,則二者有顯著性差異。

應(yīng)用Sigmaplot12繪制Isobologram分析圖,對復(fù)配混合物的聯(lián)合清除DPPH·能力進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗氧化劑對DPPH·的清除作用

圖1為三種抗氧化劑在不同濃度下(選定的濃度皆為IC50值附近的濃度)對DPPH·清除率。計算得到各抗氧化劑的IC50值分別為:Eugenol:22.23 μmol/L;α-生育酚:23.14 μmol/L;SGD:331.38 μmol/L。可以看出Eugenol抗氧化活性與α-生育酚相當(dāng),SGD抗氧化活性較低,僅為前者的十五分之一左右。

圖1 Eugenol、SGD和α-生育酚對DPPH·清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging activity of eugenol,SGD and α-tocopherol

2.2 Eugenol與SGD對DPPH·的協(xié)同清除作用

表1和圖2給出了Eugenol與SGD不同復(fù)配比例對協(xié)同抗氧化能力的影響。由表1可知,隨著復(fù)合抗氧化劑濃度的增加,其對DPPH·的清除率也逐漸增大。等效線分析圖(圖2)可直觀地看出在給定的7個比例復(fù)配后的抗氧化劑測得的IC50值在等效線分析圖上的落點(diǎn)均在理論加和線下方,表明7個比例下復(fù)配的復(fù)合抗氧化劑都具有協(xié)同抗氧化作用[21,24]。

表1 Eugenol與SGD復(fù)合抗氧化劑清除DPPH·能力Table 1 DPPH radical scavenging capacity of eugenol and SGD composite antioxidants

圖2 Eugenol和SGD聯(lián)合抗氧化的等效線分析圖Fig.2 Isobolograms for the interaction of eugenol and SGD注:F(5∶1)、F(3∶1)、F(2∶1)、F(1∶1)、F(1∶2)、F(1∶3)、 F(1∶5)在圖中分別表示Eugenol與SGD濃度的比例為 5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5。

采用t檢驗(yàn)對IC50 add和IC50 mix進(jìn)行統(tǒng)計比較,若IC50 mix

表2 不同配比Eugenol和SGD的IC50及λTable 2 Experimental,theoretical IC50 and the interaction index values for eugenol and SGD with different ratio

注:與IC50add對比***P<0.001,**P<0.01,and*P<0.05。

Eugenol與SGD復(fù)配比例在1∶2和1∶3時，其λ值相當(dāng)且最小,考慮增加SGD的量對協(xié)同作用貢獻(xiàn)度不大,因此認(rèn)為Eugenol和SGD比例為1∶2時具有最佳的協(xié)同抗氧化作用。

2.3 不同抗氧化劑對DPPH·的清除效果隨時間的變化

圖3 單一和復(fù)合抗氧化劑與DPPH· 反應(yīng)吸光度(517 nm)隨時間的變化Fig.3 Absorbance change of DPPH· scavenging assay at 517 nm in the presence of single or combined antioxidant

2.4 單一和復(fù)合物抗氧化劑與DPPH·反應(yīng)的產(chǎn)物分析

為了進(jìn)一步探究協(xié)同作用機(jī)制,采用HPLC對Eugenol,SGD以及兩者的復(fù)合抗氧化劑與DPPH·反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行了分析,出峰情況如圖4。

圖4 單一以及復(fù)合抗氧化劑 與DPPH·反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of the products of DPPH· radical scavenging reactions in the presence of single or combined antioxidant

圖4中1和2號峰分別為Eugenol和SGD的信號峰。通過對比未加任何抗氧化劑的DPPH·的HPLC譜圖,可推斷4、5為Eugenol單獨(dú)與自由基反應(yīng)的主要產(chǎn)物,而SGD單獨(dú)與自由基反應(yīng)活性低,產(chǎn)物較多且生成量少,從圖譜上看主要有6、7產(chǎn)物峰。8號產(chǎn)物峰只出現(xiàn)在復(fù)合抗氧化劑清除自由基的反應(yīng)中,從而可以推斷8號產(chǎn)物可能與Eugenol和SGD協(xié)同抗氧化作用有關(guān)。且通過對比單一抗氧化劑和復(fù)合抗氧化劑與DPPH自由基反應(yīng)產(chǎn)物,可以明顯的看出復(fù)配后,各單一抗氧化劑原有的自由基反應(yīng)產(chǎn)物4、5、7等有了不同程度的減少甚至消失,這可能與復(fù)合抗氧化劑與自由基反應(yīng)機(jī)制發(fā)生改變,更多的向著生成新產(chǎn)物8的方向進(jìn)行。

圖6 推測的協(xié)同反應(yīng)機(jī)制Fig.6 Possible synergistic antioxidant mechanism of eugenol and SGD on DPPH· scavenging

將8號產(chǎn)物分離富集后進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析,正離子模式下質(zhì)譜圖信號為389.1596。通過對反應(yīng)可能生成的產(chǎn)物以及分子量的精確計算,最后得出了該化合物可能的結(jié)構(gòu)式如圖5所示,命名為:4-((E)-3-(2,6-二甲氧基-4-(二甲氧甲基)苯氧基)烯丙亞基)-2-甲氧基環(huán)己-2,5-二烯酮。該化合物在正離子模式下的理論準(zhǔn)確分子量為389.1595,與質(zhì)譜圖信號389.1596相差0.0001。

圖5 產(chǎn)物8的高分辨質(zhì)譜圖(m/z 300～640) 及可能的分子結(jié)構(gòu)式Fig.5 High resolution mass spectrum(m/z 300～640) and possible molecular structure of the product 8

2.5 反應(yīng)機(jī)制推導(dǎo)

根據(jù)質(zhì)譜分子量信息推測的分子結(jié)構(gòu)以及文獻(xiàn)報道,推導(dǎo)出可能的反應(yīng)機(jī)制如圖6。Bondet等[25]的報道,Eugenol單獨(dú)與DPPH·反應(yīng),主要有a,b兩個途徑,這兩種途徑都是一分子的Eugenol清除兩分子的DPPH·。而復(fù)合抗氧化劑中SGD與DPPH·的反應(yīng)活性雖然很低,但其與DPPH·反應(yīng)后所得SGD自由基能與b途徑生成的醌類化合物反應(yīng),所得產(chǎn)物可再與一分子的DPPH·反應(yīng)生成產(chǎn)物8。因此復(fù)合抗氧劑中一分子Eugenol清除DPPH·沿著醌類產(chǎn)物途徑,將消耗四分子的DPPH·,其清除能力約為單一Eugenol抗氧化劑的2倍,這與2.3中得出的結(jié)果吻合。

3 結(jié)論

研究采用DPPH·清除法和等效線分析法評價了Eugenol與SGD在不同比例復(fù)配下抗氧化的相互作用,發(fā)現(xiàn)在測試的比例下兩者均表現(xiàn)出顯著的協(xié)同抗氧化作用,最佳協(xié)同比例為Eugenol∶SGD 1∶2。采用HPLC分析復(fù)合抗氧化劑與DPPH·的反應(yīng)產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)并分離得到了產(chǎn)物8,結(jié)合其高分辨質(zhì)譜分子量等信息,推測出產(chǎn)物8為4-((E)-3-(2,6-二甲氧基-4-(二甲氧甲基)苯氧基)烯丙亞基)-2-甲氧基環(huán)己-2,5-二烯酮,從而推導(dǎo)出復(fù)合抗氧劑的協(xié)同抗氧化機(jī)理,反應(yīng)中可消耗醌類產(chǎn)物,且其抗氧化能力相當(dāng)于單一Eugenol抗氧化能力的2倍,因此使用復(fù)合抗氧劑,不僅可以減少Eugenol的用量,從而避免其高濃度下促氧化的風(fēng)險,還可減少醌類物質(zhì)所引起的細(xì)胞毒性,從而極大地提高了Eugenol在抗氧化方面的應(yīng)用。