蛋白修飾植物甾醇脂質體的制備及體外消化研究

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(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023; 2.武漢輕工大學武漢市畜禽飼料工程技術研究中心，湖北武漢 430023； 3.國家糧食局糧油資源綜合開發工程技術研究中心，湖北武漢 430023)

植物甾醇(Phytosterol,PS)是存在于植物體內的具有類膽固醇結構的功能性脂質,是植物體內甾醇類化合物的統稱,歐洲食品安全局推薦每人每日應攝入1.5～3.0 g的植物甾醇,這樣可以降低人體內7%～11.3%的低密度脂蛋白膽固醇[1]。人們日常飲食中植物甾醇的含量為250 mg/d[2]左右,一些素食主義者可以達到500 mg/d[3],但由于其利用率低仍需補充攝入植物甾醇。大豆卵磷脂(phosphatidylcholine,PC)是一種兩親性離子表面活性劑,分散于水中可自發形成雙分子層封閉結構脂質體(Liposome,LS),用作藥物載體。目前,植物甾醇已被證實可取代膽固醇作為脂質體的穩定劑[4]。大豆分離蛋白(Soybean protein isolate,SPI)因其高營養價值和良好的乳化性被廣泛應用于食品工業,有學者發現,大豆蛋白與卵磷脂之間存在交互作用,可提高乳化體系的物理穩定性[5]。

由于天然植物甾醇在水中溶解性差,在健康人體內的吸收率通常小于食物中含量的5%,遠低于膽固醇35%～70%的吸收率[6],使用乳化技術可以提高植物甾醇的吸收率,Ostlund等[7]發現300 mg卵磷脂乳化的植物甾醇其降血脂效果為1 g游離植物甾醇的3倍。除此之外,將物理改性后的植物甾醇添加到乳液、微膠囊和脂質體等食品體系中,也為植物甾醇的利用提供了新的思路。錢偉等[8]采用O/W微乳化噴霧干燥法,以酪蛋白酸鈉為壁材,蔗糖為助乳化劑,蔗糖脂肪酸酯為油相得到水溶性良好的植物甾醇微膠囊;楊貝貝等[9]以植物甾醇替代膽固醇作為脂質體的包封材料,達到降膽固醇的目的,并探討了植物甾醇對脂質體結構與性質的影響。曹文君[10]利用乳化蒸發技術構建了多種食物蛋白-植物甾醇納米顆粒,研究了納米顆粒粒徑與PS生物利用率的關系,并將納米顆粒應用到蛋白凝膠體系中。

植物甾醇脂質體能夠有效提高植物甾醇在水中的溶解度,并且達到一定的降膽固醇目的,但以蛋白修飾脂質體,并考察其對植物甾醇的包封率少有報道,且脂質體易氧化、穩定性差[11],故本研究采用大豆分離蛋白對植物甾醇脂質體進行修飾,并對其包封率及復溶性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物甾醇(>95%) 武漢遠成共創科技有限公司;大豆卵磷脂(70%) Aladdin試劑公司;大豆分離蛋白 河南堅久實業有限公司;混合植物甾醇標準品(菜籽甾醇13%,菜油甾醇26%,豆甾醇7%,β-谷甾醇53%) Larodan公司;5α-膽甾烷標準品、N,O-雙三氟乙酰胺[BSTFA-TMCS(99∶1)]、胃蛋白酶(250 U/mg)、胰酶(10000 BAEE U/mg) Sigma-Aldrich公司;無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、疊氮鈉、膽鹽等均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

AL204分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;pH計 上海奧豪斯儀器有限公司;GC7890A氣相色譜儀 美國Agilent科技有限公司;Zetasizer Nano ZS激光粒度儀 英國Malvern公司;T18高速分散機 德國IKA公司;JY92-ⅡN超聲波清洗機 上海生析超聲儀器有限公司;R-3旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司;TGL205高速離心機 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;SHZ-82水浴振蕩鍋 金壇市醫療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白修飾植物甾醇脂質體的制備 蛋白溶液配制:將大豆分離蛋白以2%(w/v)比例溶于去離子水中,加入0.02%疊氮鈉,磁力攪拌溶解,調節pH至7.0,4 ℃水化過夜，得到SPI溶液。

脂質體制備[12]:采用乙醇注入法制備植物甾醇脂質體。稱取一定的植物甾醇和大豆卵磷脂,溶于一定的無水乙醇,充分攪拌溶解;用去離子水將SPI溶液稀釋至一定濃度,在高速分散(8000 r/min)條件下,用注射器將PS-PC乙醇溶液緩慢注入40 mL 1% SPI溶液,繼續分散2 min,間隔超聲(開3 s,關2 s)10 min,旋轉蒸發除去乙醇,加水稀釋至原蛋白濃度,即得蛋白修飾植物甾醇脂質體(SPI-LS)。

1.2.2 單因素實驗 根據1.2.1所示方法,在乙醇體積與大豆分離蛋白體積比為20%,大豆分離蛋白含量為1%時,考察植物甾醇與卵磷脂的比(PS∶PC為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)對包封率的影響;在PS∶LC為1∶4,SPI含量為1%時,考察不同乙醇體積比(10%、15%、20%、25%、30%)對包封率的影響;在PS∶PC為1∶4,乙醇體積比為25%時,考察不同含量(0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%)的大豆分離蛋白對包封率的影響。

1.2.3 植物甾醇標準曲線繪制及包封率測定 標曲繪制:分別量取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mL混合植物甾醇標準溶液,加入0.2 mL 5α-膽甾烷標準溶液,氮吹、衍生,氣相分析植物甾醇各組分含量,以混合植物甾醇各組分分別與5α-膽甾烷的濃度比為橫坐標,相應的峰面積之比為縱坐標,繪制標準曲線。

包封率測定方法[13]:皂化:脂質體在8000×g離心20 min,取上清液0.4 mL于50 mL試管中,加入0.4 mL 5α-膽甾烷(1.002 mg/mL)作為內標和10 mL 1.0 mol/L KOH乙醇溶液,于80 ℃水浴振蕩器內皂化1 h,取出后冷卻至室溫,在皂化液中加入5 mL水和10 mL正己烷萃取,有機相水洗3次;衍生:有機相用氮氣吹干,加入0.1 mL吡啶和0.1 mL BSTFA∶TMCS(99∶1),70 ℃衍生1 h,加入1 mL正己烷,過膜;氣相色譜條件:HP-5毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm),恒定流速1 mL/min,進樣口溫度為300 ℃,柱溫160 ℃保持2 min,10 ℃/min升至280 ℃,保持10 min,5 ℃/min升至300 ℃,保持5 min,檢測器溫度為310 ℃,分流進樣,分流比為10∶1。

式中:W為包封率;m0為上清液中植物甾醇含量,單位為毫克(mg);m1為加入的PS含量,單位為毫克(mg)。

1.2.4 粒徑與Zata電位測定 脂質體用去離子水稀釋100倍后,采用馬爾文激光粒度儀測定脂質體平均粒徑、多分散系數PdI和Zata電位。

1.2.5 SPI-LS復溶性測定

1.2.5.1 復溶液粒徑、Zata電位測定 將脂質體冷凍干燥后,取一定量的SPI-LS凍干粉溶于去離子水中至原蛋白濃度,渦旋使其充分溶解,稀釋一定倍數后,采用動態光散射技術測定其粒徑(稀釋1000倍)和電位(稀釋100倍)大小。

1.2.5.2 溶解度測定 參照彭捷[14]的方法并加以改進,稱取過量SPI-LS凍干粉溶解于一定量水中,使得樣品達到過飽和狀態,渦旋充分溶解,37 ℃水浴振蕩平衡24 h后,8000×g離心20 min,取上清液,氣相分析植物甾醇含量。

式中:S為植物甾醇溶解度(mg/mL);m0為上清液中植物甾醇含量(mg);V為加入的水的體積(mL)。

1.2.6 模擬胃腸消化

1.2.6.1 消化液的配制 模擬胃腸消化液的配制,參照Liu等[15]的報道加以改進。胃液儲備液(Simulated gastric fluid,SGF)的配制:2 g NaCl溶于800 mL去離子水中,0.1 mol/L HCl調節pH至2.0,定容至1 L,4 ℃儲藏備用;腸液儲備液(Simulated intestinal fluid,SIF)的配制:6.8 g KH2PO4溶于800 mL去離子水中,0.1 mol/L NaOH調節pH至7.0,定容至1 L,4 ℃儲藏備用。胃蛋白酶和胰酶分別用胃腸儲備液溶解,3000 r/min離心取上清液。

表2 PS∶PC對SPI-LS包埋效果的影響Table 2 Effect of PS∶PC on SPI-LS embedding quality

注:表中小寫字母表示相互之間差異顯著(P<0.05),相同字母表示相互之間差異不顯著(P>0.05)。

1.2.6.2 體外模擬胃腸消化 體外模擬胃消化[10]:將10 mL SPI-LS與9 mL SGF混合于50 mL離心管,調節pH至2.0,在37 ℃恒溫水浴搖床上,以95 r/min轉速平衡10 min,加入1 mL胃蛋白酶(80 mg/mL),開始消化實驗。分別在0、30、60 min取出1 mL,0.1 mol/L NaOH調節pH至7.0使胃蛋白酶失活,8000×g離心20 min,取上清液測定物甾醇含含量。

體外模擬腸消化[16]:經60 min胃液消化后,取上述10 mL消化液于50 mL離心管,加入9 mL SIF,用4 mol/L NaOH迅速調節pH至7.0,加入160 mg膽鹽,在37 ℃恒溫水浴搖床上,以95 r/min轉速平衡10 min,加入1 mL胰酶(160 mg/mL),分別在90、120、150、180 min取出1 mL,沸水浴2 min,迅速冷卻至室溫,8000×g離心20 min,取上清液測定物甾醇含含量。對照試驗:植物甾醇溶于無水乙醇中(2.0%,w/v),取5 mL用去離子水定容至100 mL,依次進行胃腸消化。

式中:A為植物甾醇體外生物活性;m為消化不同時間后上清液中物甾醇含含量(mg);m3為開始消化前上清液中物甾醇含的含量(mg)。

1.3 統計學處理

2 結果與分析

2.1 植物甾醇標準曲線繪制

按照1.2.3項下方法繪制標準曲線,并得到各種植物甾醇含量的標準曲線如表1所示。表明植物甾醇濃度在標準曲線范圍內,線性關系良好,因此本實驗選擇氣相色譜法作為測定植物甾醇含量的方法。

表1 植物甾醇混標各組分的線性回歸方程及相關系數Table 1 Linear regression equation and correlation coefficient of each component in mixed phytosterol standard

注:線性回歸方程中x為各組分與膽甾烷的濃度比,y為相應的峰面積之比。

2.2 單因素優化SPI-LS的制備

2.2.1 PS:PC對SPI-LS的影響 當PS-PC乙醇溶液與水混合后,卵磷脂分散在水中形成雙分子層囊泡結構,植物甾醇的嵌入可調節雙分子層的流動性及通透性作用,增加生物膜的穩定性[17]。如表2所示,當卵磷脂含量少時,植物甾醇嵌入達到飽和,過量的植物甾醇由于其弱的親水性,易在水中重結晶析出;隨著卵磷脂比例增加,脂質體粒徑逐漸減小,當PS∶PC比例達到1∶4時,植物甾醇充分包埋,繼續加大卵磷脂比例,過量的卵磷脂會形成新的脂質體,所測粒徑分布為二重峰,使得粒徑的多分散系數PdI增大,但平均粒徑無顯著變化。脂質體的Zata電位均在-30 mv以下,穩定性良好。加大卵磷脂比例有利于提高植物甾醇的包封率,由表2可知,當PS∶PC為1∶4和1∶5時,脂質體對植物甾醇的包封率顯著高于其他組(P<0.05);PS∶PC為1∶4時,植物甾醇包封率可達到95%以上,繼續增加卵磷脂比例會提高生產成本,故PS∶PC最佳配比為1∶4。

2.2.2 乙醇體積比對SPI-LS的影響 Leong[13]采用四種不同的有機溶劑制備植物甾醇納米分散液,發現利用正己烷所得分散液粒徑最小,但多分散性較差,

表3 乙醇體積比對SPI-LS包埋效果的影響Table 3 Effect of ethanol volume ratio on SPI-LS embedding quality

表4 SPI含量對SPI-LS包埋效果的影響Table 4 Effect of SPI content on SPI-LS embedding quality

以無水乙醇制得分散液粒徑較小,且PdI在0.2以下,故合適及適量的有機溶劑能夠影響納米顆粒的結構及穩定性。本文采用乙醇注入法制備植物甾醇脂質體,當乙醇體積比較小時植物甾醇與卵磷脂不能充分混勻,少量植物甾醇仍以針狀結晶存在[18],在旋蒸后進行水化的過程中,會顯著增大脂質體粒徑,造成包封率降低;加大乙醇體積比有助于植物甾醇卵磷脂的充分結合,減少水化過程的損失,但同時乙醇的存在也會造成部分蛋白變性,影響植物甾醇的包封率。乙醇體積比為25%時,包封率最高,之后繼續增加乙醇體積反而使包封率下降。故最佳乙醇體積比確定為25%。

2.2.3 SPI含量對SPI-LS的影響 在中性條件下,大豆分離蛋白和大豆卵磷脂可通過靜電相互作用和疏水相互作用可自發形成復合體系[19],不同濃度蛋白對脂質體粒徑影響較大。如表4所示,磷脂在水溶液中形成囊泡或膠束,將蛋白質包裹其中[20],隨著蛋白含量的增加,脂質體粒徑顯著增大。在蛋白含量為0.5%時,部分蛋白取代植物甾醇的位置,包封率有所下降。繼續加大蛋白濃度,卵磷脂誘導蛋白疏水基團充分暴露,提高了磷脂分子層的穩定性。但磷脂與蛋白之間存在一個結合常數,當蛋白含量為1.00%時,粒徑較小且包封率最高;當繼續加大SPI含量時,其粒徑繼續增大、但包封率有所下降。這是因為SPI含量為1.00%時蛋白的吸附剛好達到飽和,繼續增加蛋白含量,過量的蛋白會代替磷脂與植物甾醇結合,帶來一定程度的聚沉導致粒徑增大[21];在乙醇的存在下,由于蛋白的變性聚集,降低了植物甾醇的包封率。且在蛋白含量為0.25%時,植物甾醇雖然有較高的包封率,但凍干后脂質體呈塊狀,復溶性差。故最佳配方為:PS∶PC為1∶4,乙醇體積比為25%,蛋白含量為1.00%。

2.3 SPI-LS復溶性測定

根據2.2所得最優條件制備得到的SPI-LS經凍干后復溶,其溶液外觀前后無明顯差異,但粒徑大小由原來的102.5 nm增加到215 nm,粒徑分布由單峰變成了雙峰(圖1),主要是由于在冷凍干燥過程中,部分磷脂之間容易發生融合,引起SPI-LS部分團聚,使平均粒徑及其分布發生變化;用于衡量脂質體表面電位的Zeta電位在凍干前后都在-30 mV以下,說明SPI-LS穩定性良好[22]。

圖1 脂質體復溶前后粒徑分布圖Fig.1 Particle size distribution of liposomes before and after dissolution

水中植物甾醇溶解度是評價包埋體系效果的重要指標。溫娟[23]利用羥丙基環糊精對植物甾醇進行包埋,包合物中植物甾醇的溶解度可達到0.466 mg/mL;彭捷[14]測得未經處理的植物甾醇在水中的溶解度為0.0137 mg/mL,以酪蛋白為穩定劑制備植物甾醇納米粒可使甾醇溶解度達到0.798 mg/mL。本文以乙醇注入法制備蛋白修飾植物甾醇脂質體,所得凍干粉末中植物甾醇在水中溶解度為1.971 mg/mL。

2.4 植物甾醇體外消化生物活性

通過模擬胃腸環境,測定SPI-LS不同消化時段植物甾醇的生物活性,結果如圖2所示。加入胃蛋白酶進行消化,30 min后測出植物甾醇的生物活性上升至97.12%,這是因為pH為2時胃蛋白酶選擇性水解11S球蛋白,而11S被選擇性水解后,SPI的乳化活性與乳化穩定性均要比未水解的SPI高[24],所以水解30 min后植物甾醇的活性反而上升。

圖2 不同消化時間段SPI-LS與原植物甾醇的生物活性Fig.2 Bioaccessibility of SPI-LS and native PS at different digestion time

隨著蛋白的繼續水解,植物甾醇生物活性迅速下降,可能是脂質體由中性環境變為強酸性環境,pH的變化使蛋白結構舒展開來,胰酶的作用使蛋白和磷脂水解,破壞了脂質體的有序結構,使得蛋白-磷脂復合乳化體系的乳化活性與穩定性降低,故植物甾醇生物活性由原來的98.07%降到了84.43%(60 min),但植物甾醇的保留率仍可達到80%以上;繼續水解90 min,磷脂蛋白的水解產物覆蓋在脂質體表面,與膽酸鹽結合形成囊泡,避免了脂質體的進一步降解,所以經3 h胃腸消化后植物甾醇的生物活性仍可保持在50%以上。而未包埋的植物甾醇經過1 h模擬胃消化后植物甾醇的生物活性在5%左右;在腸液環境中由于膽鹽的存在,植物甾醇吸附被膽鹽乳化,生物活性升高至15%左右,與Cao結果相似[25],即在膽鹽和酶的存在下,未包埋植物甾醇的生物活性為17.8%,經酪蛋白包埋達到29.2%。

3 結論

蛋白修飾植物甾醇脂質體的最佳制備工藝為:PS∶PC為1∶4、乙醇體積比為25%、蛋白含量為1%。在此工藝下制備的SPI-LS經凍干后,復溶性良好,植物甾醇在水中的溶解度可達到1.971 mg/mL;經3 h胃腸消化后,SPI-LS中植物甾醇的生物活性仍可保持在50%以上,是未經包埋植物甾醇的三倍之多。蛋白修飾植物甾醇脂質體未添加凍干保護劑,以蛋白-磷脂間的相互作用,來提高脂質體凍干后的復溶性及消化穩定性,并能夠很好地保持植物甾醇的生物活性,為植物甾醇在食品中的應用提供技術支持,以控制食物中膽固醇的攝入,從而降低高血脂癥的發生。