貯藏溫度對真空凍干發酵劑發酵乳桿菌grx07活性的影響

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(1.揚州大學,江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室,江蘇揚州 225127; 2.廣西水牛乳工程技術研究中心,廣西南寧 530000; 3.丹陽市康力乳制品有限公司,江蘇鎮江 212000)

隨著人們保健意識的增強,乳酸菌作為有益菌被深入研究并廣泛添加于各種食品中,如保健食品、醫藥等。真空冷凍干燥法是一種能較好保持發酵劑活力的方法,但貯藏過程中多種因素可能會引起細胞壁、細胞膜結構和DNA等的變化,從而導致乳酸菌的活菌數下降,發酵活力降低甚至是失活[1-3]。

研究表明影響凍干發酵劑貯藏期菌體活力的因素包括發酵劑的制備方法、保護劑的成分、貯藏溫度、水分含量、貯藏環境中的相對濕度、氧含量等[4-10]。發酵劑制備的干燥方法有低溫干燥法、噴霧干燥法、真空冷凍干燥法。其中,低溫干燥法和噴霧干燥法制備的發酵劑活菌含量低,而真空冷凍干燥法制備的發酵劑活化后不僅活菌數量高[11-13],還便于貯藏和運輸。貯藏溫度是影響發酵劑活力的關鍵因素之一,Simpson等[14]將噴霧干燥的雙歧桿菌放在15和25 ℃貯藏時,觀察到所有雙歧桿菌的活力顯著下降,而在4 ℃貯藏能長期保持活力;Pedroso等[15]的研究表明,微膠囊化的益生菌在20 ℃貯藏時極不穩定;在7 ℃貯藏90 d后,細胞存活率只有20%;在-80 ℃貯藏90 d,細胞存活率保持在81.1%;馬振興[16]將嗜酸乳桿菌菌粉真空袋裝后置于室溫和4 ℃下保藏180 d,發酵劑活菌數下降1～5個數量級不等,而在-18 ℃貯藏180 d,發酵劑活菌數數量級均保持1011cfu/g不變。因此,發酵劑的貯藏溫度對發酵劑的活力有著顯著的影響。

發酵乳桿菌grx07是從江蘇如皋長壽村人群腸道中分離獲得,前期的研究表明其具有顯著降低慢性酒精性肝損傷,對慢性酒精肝損傷有很好的保護作用;此外,還具有顯著體外抗氧化能力和抑制致病菌能力[17]。通過高密度發酵及真空凍干法已經獲得高活菌數的grx07發酵劑,為研究貯藏溫度對grx07發酵劑活力的影響,本試驗主要從活菌數、水分活度、存活率、發酵活力、乳酸脫氫酶、β-半乳糖苷酶及ATP酶的活力等方面研究不同貯藏溫度對grx07發酵劑活力的影響,為發酵乳桿菌grx07發酵劑的開發提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發酵乳桿菌grx07 江蘇如皋長壽村人群腸道中分離獲得(樣本來自92歲健康男性);脫脂乳 新西蘭;MRS液體培養基、MRS固體培養基 青島高科技工業園海博生物技術有限公司;ATP試劑盒 南京建成生物科技有限公司;其他試劑 分析純,國藥集團。

JF-SX-500型全自動滅菌鍋 日本TOMY公司;DNP-9272型培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;FreeZone 18L凍干機 美國LABCONCO公司;DZ400-ZD型真空包裝機 上海余特包裝機械制造有限公司;LabSwift-aw水分活度測試儀 瑞士novasina;5804R型高速冷凍離心機 德國Eppeendorf公司;Multiskan go酶標儀 美國Thermo Electron公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 凍干發酵劑的制備 保護劑的配比為脫脂乳12.71%,蔗糖11.88%,谷氨酸鈉4.22%,甘油2.95%滅菌。無菌環境下保護劑和發酵劑按照體積比以1∶1的比例混勻,制成細胞懸液,放入-80 ℃冰箱預凍后在真空凍干機中凍干,凍干好的發酵劑粉碎后用錫箔袋真空包裝,分別置于20 ℃貯藏5個月,置于4、-20 ℃貯藏12個月,1～3月每半月取樣,4～12月則每月取樣分別測定發酵劑的活菌數、存活率、水分活度、發酵活力和關鍵酶活。

1.2.2 發酵劑活菌數及存活率的測定 活菌數的測定:參照國標GB 4789.35-2016[18]的方法測定發酵劑的活菌數。菌體凍干前后存活率按下式計算:

式中:μ表示菌體存活率,%;A表示未預凍或未凍干前活菌數,cfu/mL;B表示預凍后或凍干后的活菌數,cfu/mL。

1.2.3 水分活度的測定 用全自動水分活度儀測定乳酸菌凍干后的水分活度。

1.2.4 發酵劑發酵活力的測定 通過測定發酵劑發酵脫脂乳產酸pH來反應發酵劑的發酵活力,將三種溫度下貯藏的凍干發酵劑以12%(m/m)比例接至脫脂乳中,37 ℃培養6 h后,利用pH計測定發酵乳的pH。

1.2.5 關鍵酶活的測定

1.2.5.1 粗酶液的制備 移取凍干后的菌粉溶于10 mL無菌生理鹽水,用生理鹽水清洗兩次后,用10 mL的含2 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖溶液重懸菌體。取5 mL于試管中進行冰浴超聲破碎,超聲時溫度不超過4 ℃,超聲功率為25 W持續5 s,間隙5 s,循環90次,破碎15 min。破碎后在4 ℃,9000 r/min的條件下離心12 min,取上清液,即為粗酶液,用于相關酶活的測定。

1.2.5.2β-半乳糖苷酶活力的測定 繪制標準曲線:配制1 μmol/mL的ONP(鄰硝基酚)溶液,取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL,用pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液補足體積至1.0 mL,37 ℃水浴10 min后立刻加入的0.5 mol/L的Na2CO3溶液4 mL,第一個為空白,測定溶液的OD420 nm。以ONP含量為橫坐標,OD420 nm為縱坐標,繪制標準曲線。

β-半乳糖苷酶活性測定:以ONPG為底物,在β-半乳糖苷酶的作用下生成黃色產物ONP,于420 nm處測得吸光值,通過標曲找到對應濃度,按照稀釋倍數換算成最終酶活。酶活具體測定方法:取1.00 mL酶液,37 ℃水浴10 min,加入1.00 mL pH為7.0的PBS(含20 mmol/L ONPG)緩沖液,37 ℃水浴10 min后立即加入3.00 mL的0.50 mol/L Na2CO3終止反應并立即測定吸光度。

式中:W表示β-半乳糖苷酶活力,U;A表示從標曲上查到的ONP濃度,μmol/mL;B表示反應時間,min;C表示取樣體積,mL;D表示樣品蛋白濃度,mg/mL。

1.2.5.3 乳酸脫氫酶活力的測定 參照文獻[19]測定乳酸脫氫酶活力,反應體系為0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.30),30 mmol/L的丙酮酸鈉,及6.6 mmol/L的NADH共3 mL,預熱至25 ℃后加入0.1 mL粗酶液反應,立即在340 nm處測定吸光值,每30 s讀取一次,連續5 min,計算每分鐘降低的吸光值,按照下面公式計算酶活力:

式中,V總:反應總體積,mL;V樣:樣品體積,mL;ΔOD340 nm:每分鐘光密度的降低值;6.22:毫摩爾消光系數。

1.2.5.4 ATP酶活力的測定 按照試劑盒說明的方法測定Ca2+-ATP、Mg2+-ATP、Na+K+-ATP酶活力。

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復三次,采用SPSS 25和Origin 2018進行數據分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 貯藏溫度對發酵劑活菌數及存活率的影響

將真空冷凍干燥制得的發酵劑grx07置于20 ℃保藏5個月,置于4和-20 ℃保藏12個月,貯藏期間的活菌數及存活率的變化情況如圖1所示,可以看出grx07在20 ℃貯藏時活菌數快速下降,2個月時低于1×1011cfu/g,3個月后存活率低于1%;在4 ℃貯藏時,活菌數緩慢下降,6個月時,存活率為20%,活菌數為1.50×1011cfu/g,12個月時,活菌數僅為存活率僅為4.45%左右;在-20 ℃貯藏時,活菌數變化不明顯,12個月時,存活率保持在51.05%,活菌數為3.78×1011cfu/g,說明-20 ℃貯藏能較好的保持發酵劑grx07的活菌數數量。

圖1 不同溫度下發酵劑貯藏期間 活菌數(a)及存活率(b)的變化Fig.1 Changes of viable counts(a)and survival rate(b) during storage of starter at different temperatures

2.2 貯藏溫度對發酵劑水分活度變化的影響

本次實驗制得的凍干發酵劑grx07測得初始水分含量為1.58%±0.07%,水分活度為0.12,處于較好的狀態。將發酵劑置于20 ℃保藏5個月,4和-20 ℃保藏12個月,貯藏期間測得其水分活度的變化結果如圖2。在三種貯藏溫度下,隨著時間的延長,grx07的水分活度呈上升趨勢,其中在20 ℃貯藏的grx07的水分活度上升最快,3個月時水分活度大于0.23;在4 ℃貯藏時12個月菌粉水分活度為0.28;在-20 ℃貯藏12個月的菌粉水分活度為0.21。

圖2 不同溫度下發酵劑貯藏期間水分活度的變化Fig.2 Changes of water activity during storage of starter at different temperatures

2.3 貯藏溫度對乳酸菌發酵活力的影響

發酵活力是發酵劑的重要指標,可通過測定發酵劑的代謝產物來判斷發酵劑的活力,發酵乳桿菌grx07的代謝產物主要為乳酸,因此通過測定發酵乳的pH來判斷發酵劑的活力,在相同的發酵時間內,發酵乳的測定pH越低,說明發酵劑代謝產酸能力越強,發酵活力越高,反之則越低。將不同貯藏溫度不同貯藏時間下的發酵劑進行發酵試驗,測定對應的發酵乳的pH,結果如圖3所示,可以看出隨著貯藏時間的延長,三種貯藏溫度下發酵劑的發酵乳pH都在升高,說明發酵劑的活力在降低;在20 ℃貯藏3個月時發酵劑發酵乳的pH升高至6.00,發酵劑的活力降低最快;在4 ℃貯藏時前4個月發酵pH保持在4.00以下,12個月后發酵pH升高至4.83,發酵活力較低;-20 ℃貯藏12個月發酵pH保持在4.30,說明低溫能較好的保證發酵劑grx07長期貯藏的發酵活力。

圖3 不同溫度下發酵劑貯藏期間發酵活力的變化Fig.3 Changes of fermentation vigor during fermentation of fermenting agent at different temperatures

2.4 貯藏溫度對grx07發酵活力相關酶活性的影響

2.4.1 貯藏溫度對β-半乳糖苷酶活力的影響 不同貯藏溫度條件下測定grx07中β-半乳糖苷酶的酶活,結果如圖4所示,三種溫度下貯藏的grx07的β-半乳糖苷酶活力隨貯藏時間的延長都有不同程度的下降;其中在20 ℃貯藏的β-半乳糖苷酶在貯藏2個月后迅速下降,5個月時活力下降到0.68 U,僅保持了初始酶活的8.1%;在4和-20 ℃貯藏12個月時,酶的活力變化不大,分別為5.58和7.28 U,保持在較高水平。

圖4 不同溫度下發酵劑貯藏期間 β-半乳糖苷酶活力的變化Fig.4 Changes of β-galactosidase activity during storage of starter at different temperatures

2.4.2 貯藏溫度對乳酸脫氫酶活力的影響 將發酵劑置于20 ℃保藏5個月，在4和-20 ℃保藏12個月,測定發酵劑grx07乳酸脫氫酶活力在貯藏器期間的變化,結果如圖5所示,隨著貯藏時間的延長,三種溫度下grx07中的乳酸脫氫酶的活力下降;但在20 ℃貯藏時乳酸脫氫酶活力下降較快,3個月時僅剩50%;而在4和-20 ℃貯藏12個月時乳酸脫氫酶活力保持較好,分別為2.2和2.6 U,說明低溫條件下能較好保留酶活。

圖5 不同溫度下發酵劑貯藏期間乳酸脫氫酶活力的變化Fig.5 Changes of lactate dehydrogenase activity during storage of starter at different temperatures

2.5 貯藏溫度對乳酸菌ATP酶活力的影響

發酵劑grx07 ATP酶活力在貯藏器期間的變化如圖6所示,ATP酶(Na+-K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP酶)在三種貯藏溫度下都有不同程度的降低,其中在20 ℃貯藏時酶活力下降最快,貯藏5個月時Na+-K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP三種酶活力僅保持了初始的29.87%、49.02%、21.31%;在4 ℃貯藏時活力下降較慢,貯藏12個月時,Na+-K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP三種酶的活力分別保存50%以上的初始酶活;而在-20 ℃貯藏12個月時酶活力則保持70%以上的初始酶活。

圖6 不同溫度下發酵劑貯藏其間Na+-K+-ATP酶(a)、 Mg2+-ATP酶(b)、Ca2+-ATP酶(c)酶活力的變化Fig.6 Changes of Na+-K+-ATPase(a),Mg2+-ATPase(b) and Ca2+-ATPase(c)activity in fermentation agents stored at different temperatures

3 討論與結論

真空冷凍發酵劑需具有活菌數高、貯存時間長,菌種穩定等特點。然而,在貯藏期間,貯藏溫度[14-16]、水分含量[20-21]、貯藏環境中的相對濕度[22]、氧含量[23-24]等均可以影響發酵劑的活力。而本實驗以發酵劑grx07的存活率、活菌數、水分活度、發酵活力及影響乳酸菌代謝活力的關鍵酶活為指標,測定20、4、-20 ℃三種不同貯藏溫度發酵劑grx07活力的影響。

研究表明,儲藏期間的發酵劑存活率與儲存溫度成負相關,發酵劑grx07在-20 ℃貯藏12個月的存活率最高,活菌數保持在3.78×1011cfu/g,在此溫度下,發酵劑水分活度在貯藏期內上升較慢。水分活度是影響發酵劑穩定性的重要原因,Mille等[25]的實驗數據顯示細胞含水量與細胞存活率成正相關。而Kurtmann等[26]發現凍干發酵劑的水分活度在0.11～0.22之間時菌體存活率較高,當水分活度大于0.22時,易發生氧化或褐變,對細胞造成一定的損害,導致貯藏性降低。發酵劑grx07在凍干過程中,會脫去自由水和部分結合水,細胞進入休眠期,但在貯藏過程中,逐漸吸收環境中的水分,使水分活度上升,但在-20 ℃貯藏12個月后水分活度仍低于0.21。

發酵劑的發酵活力是發酵劑活菌數之外的另一個用于衡量凍干發酵劑能否直接用于生產的重要指標。利用不同溫度貯藏下的發酵劑制備發酵乳,-20 ℃貯藏12個月后發酵活力最好且顯著高于20 ℃貯藏的發酵活力,與菌種發酵活力相關的酶主要有乳酸脫氫酶、β-半乳糖苷酶及ATP酶,其中乳酸脫氫酶是乳酸菌利用碳源將丙酮酸轉化為乳酸的關鍵酶,其活力大小是影響乳酸菌產酸能力的因素之一,β-半乳糖苷酶是乳酸菌乳糖代謝過程的關鍵酶,能將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖,其活力高低是反應發酵劑活力高低的因素之一,而ATP酶對維持細胞生理功能有著非常重要的作用,分為三種,Na+-K+-ATP是細胞質膜雙分子層中的一種蛋白質,具有載體和酶的作用,催化ATP水解供能,維持細胞膜兩側的膜電位、調節細胞滲透壓,為營養物質的吸收提供動力等方面起著重要作用;Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶是另兩種重要的膜酶,主要功能是調節細胞內Ca2+和Mg2+的濃度[27],因此乳酸菌ATP酶活力大小對乳酸菌活力有著重要的影響。發酵劑grx07乳酸脫氫酶和β-半乳糖苷酶在貯藏期內都呈下降的趨勢,但在-20 ℃貯藏酶12個月活力仍保持在80%以上。三種ATP酶在三種貯藏溫度下都有不同程度的降低,其中在20 ℃貯藏時酶活力下降最快,而在-20 ℃貯藏12個月時酶活力則保持70%以上的初始酶活。因此,發酵劑在-20 ℃貯藏保持較高活力可能是因為低溫酶變性緩慢,使發酵活力相關的酶在貯藏期間仍具有較高的活力。

本研究表明貯藏溫度越低,在較長的貯藏時間內,發酵劑活力保持相對越高。貯藏期內保持高活性是真空冷凍發酵劑用于生產的一個必須環節,但發酵劑貯藏期活力的變化是多因素相互作用的結果,因此,在本研究的基礎上,還需要對貯藏期影響發酵劑活力的其他因素如水分含量、貯藏環境中的相對濕度、氧含量等進行進一步的系統研究。