微滴式數字PCR檢測冷凍草莓中GⅠ、GⅡ型諾如病毒

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(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266000; 2.山東青島海關檢驗檢疫技術中心,山東青島 266000)

諾如病毒(norovirus,NV)是引起急性無菌性胃腸炎和兒童腹瀉的主要病原之一,1972年采用免疫電鏡方法,在胃腸炎病人糞便標本中檢出一種以前沒有見到過的小圓形病毒顆粒,命名為“小圓結構病毒”,“諾瓦克病毒”[1]。諾如病毒可以通過人與人之間直接傳播,或接觸到被污染的水和食物而進行傳播。在日常環境和烹飪條件下并不能完全殺滅[2-3],從感官體驗上幾乎不能判斷食物是否被病毒污染。而人類對諾如病毒普遍易感,10～100個病毒粒子即可引發感染,因此常因食品污染諾如病毒,造成嚴重的食品安全事件[3]。2012年,德國學校食堂發生了10952人次感染諾如病毒的大面積急性腸胃炎事件,同時伴隨著腹瀉、嘔吐、高熱等癥狀,調查顯示是冷凍草莓被污染諾如病毒引起[4]。所以,對諾如病毒的研究和防治具有重要的現實意義。

目前,諾如病毒不能在體內繁殖,也無動物模型,沒有合適的組織細胞培養系統,采用電鏡法、酶聯免疫法和PCR法檢測是諾如病毒檢測的常用方法[5]。在食品中污染的諾如病毒數量少,一般都少于104copy/10 g,電鏡檢測的靈敏度為105～106個病毒粒子/mL,食源性諾如病毒可能超過電鏡法的最低檢測限[4-5];酶聯免疫法也因食品中諾如病毒含量較少,抗原特異性不強,導致檢測靈敏度過低,不能滿足日常檢測要求[6]?，F有的RT-qPCR技術檢測諾如病毒因樣品染毒濃度低,同時存在檢測過程中受抑制物影響而導致無法檢測的情況[7]。微滴式數字PCR原理是將含有核酸模板的標準PCR反應體系,平均分配成數百萬個PCR反應到微滴中,使每個反應中都盡可能含有一個模板分子,進行單分子模板PCR反應,有熒光信號記為1,無熒光信號記為0,然后經過統計學泊松分布的校準進行絕對定量[8-10]。

近年來,利用微滴式數字PCR對甲型流感病毒進行定量分析[10],有學者通過對食品中GⅠ型諾如病毒進行研究,以獲得ddPCR在食品致病微生物檢測領域的基礎性證據[11-13]。本文將RT-ddPCR應用到冷凍草莓樣品GⅠ和GⅡ型諾如病毒的檢測中,目前國內還未見相同報道,通過研究RT-ddPCR用于諾如病毒檢測的最佳退火溫度、靈敏度、特異性、重復性實驗,建立了RT-ddPCR檢測諾如病毒的絕對定量技術,以期應用到小劑量食源性病毒的檢測中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍草莓 青島海關出入境檢驗檢疫實驗室各公司送檢散裝樣品,-20 ℃保存,1周內檢測;30 U果膠酶(Sigma p2401) 美國Sigma公司;Tris/Glycine/Beef extract(TGBE)緩沖液(Tris base 12.1 g、甘氨酸3.8 g、牛肉浸出粉10 g、雙蒸水補充至1 L,pH調節至9.5,高壓滅菌)、PBS(5×PEG,50 g/100 mL PEG 8000,1.5 mol/L NaCl,高壓滅菌)、1 mol/L鹽酸、氫氧化鈉溶液、氯仿、正丁醇等化學試劑(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;Qiagen RNEASY Mini Kit(74104) 德國Qiagen公司;One-Step TM PCR Inhibitor Removal Kit 美國Genemed Synthesis公司;One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes、ddPCRSupermix for Probes(no dUTP) 美國BIO-RAD公司;AmbionAgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit(AM1005) 美國ABI公司。

LC480熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司;QX200 Droplet Digital PCR System 美國BIO-RAD公司;5804R高速低溫離心機(50 mL) 德國Eppendorf公司;BagPageR無菌勻質袋 法國Interscience公司;MLS-3750高壓滅菌鍋、WDF-U4186S超低溫冰箱 松下健康醫療器械(上海)有限公司;蛋白核酸檢測儀 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物和探針 參照ISO/TS 15216-2:2013[14]合成引物與探針,Norovirus GⅠ正向引物:CGC TGG ATG CGN TTC CAT;反向引物:CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC;探針:FAM-TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT-TAMRA。Norovirus GⅡ正向引物:ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA;反向引物:TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA;探針:VIC-AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG-TAMRA。

1.2.2 樣品前處理 稱取5～10個冷凍草莓放入帶濾網的均質袋中,向均質袋中加入35 mL已混30 U果膠酶黑曲素的TGBE緩沖液,調節pH至9.5,在室溫下60 r/min恒定搖晃孵育20 min。孵育過程中每隔10 min檢測樣品pH,若pH小于9.0,則使用NaOH調節至pH9.5(酸性水果孵育過程中會使pH下降),若調節了pH,則應延長10 min的孵育時間。收集洗脫液于50 mL離心管中,10000×g離心30 min,4 ℃離心澄清,取上清液至新離心管。

1.2.3 病毒富集 使用HCl調節上述離心上清溶液酸堿度至7.0,加入四分之一體積的PEG溶液渦旋振蕩1 min,使樣品溶液充分混勻,之后持續在4 ℃振搖4 h或靜置過夜。4 ℃條件下10000×g離心30 min,棄上清液,在4 ℃條件下10000×g離心5 min,使沉淀緊實后用移液槍移去廢液棄掉,加500 μL PBS蝸旋振蕩,使沉淀重新溶解,室溫靜置5 min,4 ℃條件下10000×g離心5 min,吸上清液置于2 mL無菌離心管,加入等體積有機溶劑氯仿-正丁醇,蝸旋混合后靜置5 min。4 ℃、10000×g離心15 min,與有機溶劑混合明顯分層,將上層水相小心移至新離心管中,-20 ℃保存用于提取病毒RNA[8,15]。

1.2.4 病毒RNA提取 按照Qiagen RNEASY Mini Kit(74104)試劑盒說明書,提取樣品中病毒RNA,最終溶于100 μL RNase水,-80 ℃保存,用于后續微滴式數字PCR實驗。

1.2.5 陽性對照的制備 諾如病毒原液:由實驗室檢測獲得諾如糞便懸液,使用1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)10倍稀釋,旋渦振蕩混勻,用離心機8000×g離心20 min,上清液分裝至1.5 mL離心管,作為陽性對照,-80 ℃貯存備用[8]。

1.2.6 質粒標準品的制備 以諾如病毒的核酸為模板,使用1.2.1設計的引物進行擴增,擴增長度為280 bp,將擴增產物連接至載體,然后轉化為感受態細胞,將篩選的陽性重組質粒測序。測序結果在NCBI上進行BLAST分析,序列正確的陽性質粒即為諾如病毒GⅠ、GⅡ的標準品。

1.2.7 方法學實驗

1.2.7.1 RT-ddPCR退火溫度的優化 退火溫度為引物和模板結合時候的溫度參數,是影響 RT-ddPCR特異性的較重要因素,過低時可能導致非特異性擴增,過高時會使反應的靈敏度下降[15-16]。采用RT-ddPCR推薦的反應體系(One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes 20 μL),使用同一樣品的RNA核酸,對退火溫度進行研究。根據信號讀取結果判斷優化體系。設置GI,GII型諾如病毒的退火溫度為63.0、62.4、61.4、59.9、58.1、56.5、55.6、55.0 ℃,將擴增完的96孔板放進QX200微滴讀取儀上,進行結果讀取。雙通道檢測GI,GII型諾如病毒,根據信號讀取結果判斷最優反應體系。

表1 RT-ddPCR反應條件Table 1 RT-ddPCR reaction conditions

1.2.7.2 RT-qPCR反應和 RT-ddPCR反應 RT-qPCR反應體系(20 μL):TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL,10 μmol/L的上下游引物各1.8 μL,10 μmol/L的探針0.5 μL,RNA模板2 μL,無RNase超純水3.9 μL。反應設置條件為:50 ℃ 2 min;95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min。

RT-ddPCRddPCRSupermix for Probes(no dUTP)反應體系(20 μL):TaqMan mix 10 μL;10 μmol/L的上下游引物各1.8 μL,10 μmol/L的探針0.5 μL,DNA模板2 μL,無RNase超純水3.9 μL。

反應體系(One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes 20 μL):Supermix 5 μL,Reverse transcriptase 2 μL,300 nm DTT 1 μL,10 μmol/L的上下游引物各1.8 μL,10 μmol/L的探針0.5 μL,RNA模板2 μL,無RNase超純水5.9 μL。轉移油滴進入96孔板,封好膜后在30 min內進行PCR反應,將擴增完的96孔板放進QX200微滴讀取儀上,進行結果讀取。

1.2.7.3 靈敏度實驗和線性關系分析 將諾如病毒 GⅠ,GⅡ的標準品進行10倍梯度稀釋,連續稀釋8次記為S1～S8,進行RT-ddPCRSupermix for Probe實驗,記錄拷貝數,確定標準曲線和數字PCR的檢測范圍。

1.2.7.4 特異性實驗 用上述1.2.2和1.2.3方法提取諾如病毒,輪狀病毒,腺病毒進行RT-ddPCR檢測,確定該實驗方法的特異性。

1.2.7.5 重復性實驗 為了證明體系的重復性,對樣品重復3次進行RT-ddPCR實驗,每1周進行檢驗一次,連續3周,計算標準差和相對標準差,判斷該方法重復性和穩定性。

1.2.8 送檢樣品 對送檢的草莓樣品進行RT-ddPCR定量檢測。與RT-qPCR進行比較,判斷該方法的準確性。

1.3 數據處理

實驗結果采用QX200 Droplet Digital PCR System 提供的Quantasoft軟件(Bio-Rad)進行分析處理。

2 結果分析

2.1 退火溫度的確定

在不同退火溫度下63.0、62.4、61.4、59.9、58.1、56.5、55.6和55.0 ℃(A01-H01對應8個溫度梯度)對GⅠ型諾如病毒進行RT-ddPCR反應,得到如圖1所示散點圖,橫坐標表示微滴數,縱坐標表示熒光信號強度,可以直接在Quantasoft軟件上直接讀取微滴數和拷貝數,對應的拷貝數分別為91.1、145.5、212、228、229、233、232和228 copies/μL,單個樣品孔內生成的總微滴數是檢驗實驗好壞的重要指標,可接受的平均微滴數目為10000[10],本實驗反應平均微滴數為12139,表明所有反應的微滴生成正常,陰陽微滴有明顯分層,保證了后續實驗結果分析的準確性,在溫度為56.5 ℃時,樣品拷貝數最高,為233 copies/μL。表明此退火溫度能夠保證 RT-ddPCR法定量檢測GⅠ型諾如病毒結果的可靠性,將GⅠ型諾如病毒 RT-ddPCR反應的退火溫度選為56.5 ℃。

圖1 諾如病毒GⅠ 8個溫度梯度RT-ddPCR一維散點圖Fig.1 Temperature gradient ddPCR one-dimensional scatter plot of NV GⅠ

同樣的溫度梯度,對GⅡ型諾如病毒進行RT-ddPCR反應,得到如圖2所示散點圖,樣品拷貝數分別為76.9、78.3、67、62.8、72.8、69.3、65.6和71.1 copies/μL。圖2中3526處的短橫線為閾值線,熒光信號強度為3526時能更清晰直觀的反映陰陽性微滴是否分開,圖3顯示63和62.4 ℃時,拷貝數分別為76.9和78.3 copies/μL,陰陽微滴界限不明顯,實驗結果不準確。圖4顯示在溫度為58.1 ℃時,樣品拷貝數為72.8 copies/μL,陰陽微滴分層明顯,并且分布于中間的不易判定陰陽性的微滴數目較少,微滴數量和質量都較好,說明擴增效果良好,結果較為準確[11]。表明此退火溫度能夠保證RT-ddPCR法定量檢測GⅡ型諾如病毒的結果的可靠性。將GⅡ型諾如病毒的RT-ddPCR反應的退火溫度選為58.1 ℃。

圖2 諾如病毒GⅡ 8個溫度梯度RT-ddPCR一維散點圖Fig.2 Temperature gradient ddPCR one-dimensional scatter plot of NV GII

圖3 退火溫度為63、62.4 ℃的 RT-dd PCR法檢測GⅡ型諾如病毒的直方圖Fig.3 Histogram of GII Norovirus detected by RT-dd PCR with annealing temperature of 63,62.4 ℃

圖4 退火溫度為58.1 ℃的RT-dd PCR法 檢測GⅡ型諾如病毒的直方圖Fig.4 Histogram of GII Norovirus detected by RT-dd PCR with annealing temperature of 58.1 ℃

2.2 RT-ddPCR線性分析

從圖5、圖6中可以看出,隨著質粒濃度降低,陽性微滴數減少,陰性微滴數增加,生成的微滴數最低為12134,最多為19432均大于10000,平均為16139,說明生成的微滴質量和數量較好,結果準確可靠。S1～S3質粒濃度過高,超出檢測范圍,圖5中GⅠ質?？截悢捣謩e為9000、1934、183、25.6、5.6 copies/μL,圖6中GⅡ質粒拷貝數分別為7000、659、68.6、9.2和1.8 copies/μL。以質?？截悢档膶禐榭v坐標,RT-ddPCR檢測諾如病毒GⅠ標準曲線線性方程為y=-0.829x+4.819,決定系數R2=0.9947,RT-ddPCR檢測諾如病毒GⅡ標準曲線線性方程為y=-0.9035x+4.6543,決定系數R2=0.995,線性關系良好,表明該方法結果準確可靠。

圖5 GⅠ質粒濃度梯度稀釋RT-ddPCR一維散點圖Fig.5 RT-ddPCR one-dimensional scatter plot of GI concentration gradient dilution

圖6 GⅡ質粒濃度梯度稀釋RT-ddPCR一維散點圖Fig.6 RT-ddPCR one-dimensional scatter plot of GⅡ concentration gradient dilution

圖7 GⅠ型諾如病毒的線性關系Fig.7 Linear relationship of GI type norovirus

圖8 GⅡ型諾如病毒的線性關系Fig.8 Linear relationship of GII type norovirus

2.3 RT-ddPCR特異性實驗

本實驗建立的方法對輪狀病毒,腺病毒均無明顯擴增,A12為諾如病毒的拷貝數為388 copies/μL,B12、C12為輪狀病毒與腺病毒檢測結果No Call,說明該方法具有特異性。

表2 RT-ddPCR重復性實驗Table 2 RT-ddPCR repeatability experiment

圖9 RT-ddPCR特異性試驗Fig.9 Specificity test of NoV with droplet digital PCR注：從左往右分別為388 copies/μL,No Call,No Call，空白。

2.4 重復性

通過組間重復和組內重復實驗分析RT-ddPCR的重復性,結合實驗結果的標準偏差和相對標準偏差對實驗的準確性進行判定[17]。對提取的GⅡ型諾如病毒RNA進行10-1～10-7稀釋,稀釋度為10-1～10-3時,濃度過高,超出檢測范圍。在稀釋度為10-7時,RT-ddPCR法的RSD 為3.8%,精密度最好,在稀釋度為10-10即濃度最低時,RT-ddPCR法的RSD為28.78%,精密度最差,說明在濃度很低時,RT-ddPCR法的重復性不佳。在實際應用過程中,應注意樣品濃度不宜過高或過低,確保實驗重復性良好。

2.5 應用于實際樣品的檢測

經過病毒富集后,將實驗室送檢諾如病毒陽性樣品稀釋,進行RT-qPCR和RT-ddPCR定量,微滴式數字PCR的定量結果分別為:420、42、4.1、3.9、3.2、1.8 copies/μL。RT-qPCR擴增曲線如圖10所示,呈“S”型,從左到右分別表示稀釋度為10-1～10-5時擴增曲線,稀釋度為10-6、10-7時,RT-qPCR與陰性對照均無明顯擴增,所以RT-qPCR法的靈敏度為稀釋度為10-5的諾如病毒陽性樣品的濃度,其Ct值為33.69(Ct<35),而RT-ddPCR在微滴生成正常,滿足泊松分布的條件下,在稀釋度為10-6時實測質粒標準品的拷貝數濃度為1.8 copies/μL,所以RT-ddPCR法的靈敏度比RT-qPCR法高一個數量級。最低檢測限低至個位拷貝數,在RT-ddPCR的檢測范圍內,利用建立好的RT-ddPCR的方法對臨床標本進行了準確定量,可以運用到實際樣品的檢測。

圖10 RT-qPCR檢測不同稀釋度 諾如病毒樣品的RNA擴增圖Fig.10 RT-qPCR detection of RNA amplification of different dilutions of Norovirus samples

3 結論與展望

一步法微滴式數字PCR系統包括微滴生成器、PCR儀和微滴分析儀三部分組成,檢測冷凍草莓中的諾如病毒,實驗方法的準確性是由反應擴增后累計的熒光信號的強弱決定的,而熒光信號的累積與PCR擴增效率密切相關[18-19]。因為RT-ddPCR不受PCR抑制物的影響,PCR擴增效率與PCR擴增體系中的引物、探針濃度和退火溫度密切相關[13]。RT-ddPCR是將含有核酸模板的反應體系分配成小的PCR反應,所以RT-qPCR的反應體系可能不適合RT-ddPCR反應,需要對擴增過程進行優化以達到RT-ddPCR的最優效果。優化RT-ddPCR的退火溫度,確定了RT-ddPCR檢測GI型、GⅡ型諾如病毒退火溫度為56.5、58.1 ℃。RT-ddPCR的檢測結果與GⅠ質粒標準品拷貝數的決定系數R2=0.9947,與GⅡ質粒標準品拷貝數的決定系數R2=0.995,說明該方法具有良好的線性關系。濃度過高超出檢測范圍時,RT-ddPCR檢測結果全為陽性,RSD最小為3.8%,表明該實驗重復性良好。在濃度較低時,RT-ddPCR的重復性不佳。所以在臨床樣品的檢測中要確保樣品濃度在檢測范圍內,使實驗結果準確可靠。本實驗在研究特異性的時候,因為病毒樣品資源的限制,只做了諾如病毒與輪狀病毒、腺病毒的RT-ddPCR反應,對輪狀病毒和腺病毒幾乎無擴增,說明該方法具有特異性。對送檢樣品做RT-ddPCR和RT-qPCR作對比RT-qPCR擴增曲線呈“S”型,說明熒光定量結果準確可靠,結果顯示RT-ddPCR最低檢測限低至個位拷貝數,RT-ddPCR法的靈敏度比RT-qPCR法高一個數量級,說明RT-ddPCR靈敏度高。

本研究建立的諾如病毒RT-ddPCR法具有特異性強、靈敏度高、檢測限低等優點,但也有自己的不足,濃度過高超出檢測線的樣品會導致結果不準確,閾值線的設置可能會導致結果的偏差,反應微粒處于閾值線附近的微滴因為閾值線的變動,被定義為陰性或者陽性,造成錯誤的結果[20]。因此,在樣品檢測過程中,需要保證樣品濃度處于檢測范圍內,濃度過高可以稀釋后再檢測。陰性峰和陽性峰明顯分開,分布在中間不易界定陰陽性的微滴數少,微滴生成平均在一萬以上以確保實驗結果的準確可靠。在加樣過程中,因為微滴發生板不允許出現氣泡,擴大1.1倍,配制22 μL體系,使誤差減小。微滴生成器,PCR擴增儀和微滴分析儀在使用前進行預熱,達到機器使用的最好狀態。

本研究建立了基于一步法微滴式數字PCR技術對冷凍草莓中諾如病毒絕對定量的方法,減少了兩步法和熒光定量PCR中可能出現的污染,并可對臨床樣本中的病毒含量進行絕對定量,該方法的最低檢測限可以低至個位拷貝數,給小劑量感染諾如的食品檢測提供了新方法,對諾如病毒引起的胃腸炎的防治,監測治療等方面具有重要意義。