基于16S rDNA高通量測序技術分析北京豆汁兒微生物多樣性和功能預測的研究

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(1.北京農業職業學院,北京 102400; 2.廣東輕工職業技術學院,廣東高校特色調味品工程技術開發中心(GCZXB1103),廣州 510300)

豆汁兒是由綠豆自然發酵而來的北京特有傳統食品,具有降燥解毒、促進脾胃功能、消暑降溫的功效[1-6]。豆汁兒聞之有酸臭味(與泔水味相似),入口以酸味為主伴有回甘,其獨特的風味是由微生物發酵產生的。目前,豆汁兒中微生物的相關報道較少,有文獻表明豆汁兒中存在乳酸乳球菌乳酸亞種[7]。通過宏基因組學對微生物的種屬組成、豐度及其優勢菌進行研究分析是目前微生物學研究的熱點[8-10],被廣泛運用于食品微生物研究領域[11-14]。通過微觀層面的科學研究,人們對微生物菌落有了全面的認識[15-18]。以環境樣品中總微生物基因組為研究對象,通過測序分析和功能基因篩選等對樣本中的微生物進行較全面的分析,如:菌落多樣性分析、樣本與物種關系分析等[19-22]。其中,16S rDNA測序分析技術最為常用,在不對微生物進行純化培養的情況下,直接從食品生態系統中獲取基因信息對其進行測序分析[23-26]。

本文通過16S rDNA測序對豆汁兒中所含微生物的種屬類型、種類的相對豐度以及樣本與物種的關系等進行分析,從而了解豆汁兒中菌落組成及其優勢菌種,以期為豆汁兒的科學安全生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆汁兒 來自北京不同城區具有代表性的6家豆汁兒店,編號分別為A、B、C、D、E、F。

HR/T16M臺式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;YXQ-LS-50SII壓力蒸汽滅菌器 上海篤特科學儀器有限公司;JA2003 電子天平 上海精密科學儀器有限公司;高通量測序儀 Illumina(Miseq);中科美菱DW-HL290超低溫儲存箱 上海旦鼎國際貿易有限公司。

表1 Alpha多樣性分析Table 1 Alpha diversity analysis

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物16S rDNA測序的樣品前處理方法 分別取6種豆汁兒,立即用12000 r/min轉速的高速冷凍離心機4 ℃條件下離心30 min,去除上清液后放入-80 ℃的超低溫儲存箱保存,同一家店分三批次取樣混合均勻。

1.2.2 16S rDNA PCR擴增 選擇799F和1193R作為引物,引物序列分別為AACMGGATTA GATACCCKG和ACGTCATCCCCACCTTCC。為了保證后續數據分析的準確性及可靠性,在可行范圍內使用低循環數擴增并保證每個樣品擴增的循環數統一。擴增體系為:TransStart Fastpfu DNA Polymerase,20 μL反應體系,其中包括:4 μL的5×FastPfu Buffer,42 μL的2.5 mmol dNTPs,0.8 μL的Forward Primer(5 μmol/L),0.8 μL的Reverse Primer(5 μmol/L),0.4 μL的FastPfu Polymerase,0.2 μL的BSA,10 ng的Template DNA,補ddH2O至20 μL。PCR反應參數:a. 95 ℃預變性3 min;b. 循環數×(95 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸45 s);c. 72 ℃延伸10 min,至10 ℃停止。

二輪擴增:一輪引物 799F,退火55 ℃,27個循環;二輪引物 799F-1193R,退火55 ℃,13個循環。測序工作由北京美吉桑格生物醫藥科技有限責任公司完成。

1.2.3 16S rDNA功能預測分析 16S rDNA功能預測是通過PICRUSt軟件(PICRUSt軟件[27]存儲了Greengene ID對應的Clusters of Orthologous Groups of Proteins(COG)信息和KEGG Ortholog(KO)信息)對OTU豐度表進行標準化,即去除16S marker gene在物種基因組中的copy數目的影響;再通過每個OTU對應的Greengene ID,比對到COG和KEGG庫,獲得OTU對應的COG家族信息和KO信息;并計算各COG的豐度和KO豐度。根據COG數據庫的信息,可以從EggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups,http://eggnog.embl. de/)數據庫中解析到各個COG的描述信息,以及其功能信息,從而得到功能豐度譜;根據KEGG數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因和基因組百科全書,http://www.genome.jp/kegg/)的信息,可以獲得KO、Pathway、EC信息,并能根據OTU豐度計算各功能類別的豐度。針對Pathway,運用PICRUSt軟件可獲得代謝通路的3個水平信息及各個水平的豐度表。

1.3 數據處理

采用Circos-0.67-7、PICRUSt軟件、R語言工具統計和作圖,Excel進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 樣本OTU及Alpha多樣性分析

除去低于置信閾值的分類譜系外,6個豆汁兒樣品總共獲得有效序列204144條。按照97%相似水平對OTU進行統計分析,6個豆汁兒樣品中,OTU50數量最多,共有53613個,其對應的菌種是食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria);OTU35次之,共有50080個,其對應的菌種是沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)。豆汁兒樣本中包含的物種分類個數統計結果為:域1個;界1個;門5個;綱8個;目13個;科21個;屬35個;種51個;OTU 70個。

各樣本OTU數目、Ace豐富度指數、Chao1豐富度指數、測序深度指數、Shannon指數及Simpson指數見表1。由表1可知,樣品E的Ace豐富度指數為76.02;Chao1豐富度指數為88.25,是所有樣品中菌群豐度最高的。由Shannon指數可知,樣品B多樣性最高,Shannon指數最大為1.96。6個豆汁兒樣品的Simpson指數值在0.21～0.27區間內,說明菌落多樣性相似度較高。

2.2 物種組成分析

2.2.1 物種Venn圖分析 圖1為6個豆汁兒樣品在種分類水平上的物種Venn圖。如圖1所示,6個樣品共有物種數目22種;樣品E和樣品F共有物種數目最多,有42種。由此得出樣品E與樣品F物種相似度高。共有物種數目在35種以上的群組有:E&F、D&E、B&E、D&E&F、D&F。

圖1 OTU交集韋恩圖Fig.1 Intersected Venn diagram analysis of OTU

6個豆汁兒樣品合并后微生物物種分布如圖2所示。食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)占比最多為25.73%;次之為沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei),占比為24.63%。與樣本OTU統計分析分析結果相吻合。

圖4 菌落熱圖Fig.4 Community heatmap

圖2 物種分布餅圖Fig.2 Species distribution pie map

2.2.2 菌落組成分析 基于目分類水平柱形圖3結果表明:不同樣本在目水平優勢物種相同,乳桿菌目(Lactobacillales)占比最大,6個樣本中乳桿菌目都在95.8%以上,其他菌目占0.2%以下;B樣品中有3.7%的雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)。由此看出,豆汁兒的發酵是以乳桿菌目為主的,不同來源的豆汁兒,其所含微生物相似度極高。

圖3 基于目分類水平的菌落柱形圖Fig.3 Community barplot analysis based on category level

2.2.3 群落Heatmap圖 樣品A～F這6個樣本的群落屬水平物種組成熱圖和樣本聚類樹分析如圖4所示,在屬分類水平上,根據豆汁兒樣本間物種相對豐度的相似性進行聚類,對聚類后各樣品中不同菌屬所含序列的豐度作菌落熱圖,可使高豐度和低豐度的物種分塊聚集,反映出在屬分類水平上所有豆汁兒樣品菌落結構的相似性和差異性。

熱圖共展示35個屬,不同豆汁兒樣本中TOP5門類組成存在差異。其中樣品A、樣品B、樣品D、樣品E、樣品F占比最大的為乳桿菌屬(Lactobacillus),是豆汁兒中的優勢菌屬;而樣品C占比最大的是魏斯氏屬(Weissella)。且樣品A～F 6種樣品中優勢菌種的組成相似,菌種類別統一度高,均含有乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)和魏斯氏屬(Weissella);6種樣品菌屬的豐度指數存在差異,表明菌屬的占比量不同。

2.2.4 樣本與物種關系分析 在種分類水平上的Circos圖分析結果如圖5。A～F 6種樣品中優勢菌種的組成相似,但占比不同,其中B、D和E的優勢菌種均為沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei),該菌種在樣本中的占比分別為37%、32%和31%;樣品C和F的優勢菌種是食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria),在樣本中的占比分別是:44%和35%;樣品A的優勢菌種是一種未分類的乳桿菌,該菌種在樣本的占比為37%。有研究表明:沙克乳酸桿菌能夠抑制食物腐敗菌和食源性病原體[28],本研究中,樣品B、D、E中存在該菌種,因此推測對豆汁兒中的腐敗菌具有抑制作用。

圖5 Circos樣本與物種關系圖Fig.5 Circos sample and species diagram

樣品A、D和E這3個樣品中,均存在食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria),分別占比均為22%、26%、28%,食竇魏斯氏菌不產生物胺類物質,耐低酸、膽鹽,可促進發酵食品的風味形成[29-30]。

2.3 功能預測分析

16S功能預測是通過PICRUSt軟件對OTU豐度表進行標準化后,通過每個OTU 對應的Greengene Id獲得OTU對應的COG家族信息和KEGG Ortholog(KO)信息,并計算豐度。由于乳桿菌目(Lactobacillales)占比95.8%以上,是豆汁兒發酵過程中的優勢菌目,因此以乳桿菌目(Lactobacillales)對應的OTU數據(篩選后的OTU命名a～f),進行功能預測分析。

2.3.1 COG數據庫注釋分析 COG是由NCBI創建并維護的蛋白數據庫[31]。圖6是COG功能分類統計圖。由圖6可知,樣本a～f的COG功能組成相似度高,功能注釋結果分為25 類。功能性強的前五類分別是:G:碳水化合物轉運和代謝,均值963750個;R:一般功能預測,均值為794154個;E:氨基酸轉運與代謝,均值743039個;K:轉錄,均值726421個;J:翻譯,均值669363個;此外發現均值1005492個功能未知的基因,有待今后進一步研究。

圖6 COG功能分類統計圖Fig.6 COG functional classification statistical map

注:A. RNA加工與修飾;B.染色質結構與動力學;C.能量產生與轉化;D.細胞周期調控、細胞分裂,染色體分隔;E.氨基酸轉運與代謝;F.核苷酸轉運和代謝;G.碳水化合物轉運和代謝;H.輔酶轉運與代謝;I.脂質轉運與代謝;J.翻譯,核糖體結構和生物合成;K.轉錄;L.復制,重組和修復;M.細胞壁/細胞膜的生成;N.細胞運動;O.翻譯后修飾,蛋白質轉換,伴侶;P.無機離子轉運與代謝;Q.次級代謝產物的合成、轉運和代謝;R.一般功能預測;S.未知功能;T.信號轉導機制;U.細胞內的轉運、分泌和囊泡運輸;V.防御機制;W.胞外結構;Y.核結構;Z.細胞骨架。

2.3.2 KEGG數據庫注釋分析 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)即京都基因和基因組百科全書,始于1955年,將基因、基因組信息以及更高層次的功能信息結合起來,對基因的功能進行系統化分析[32]。表2是KEGG代謝通路Level 2豐度分析結果。Level 2豐度分析共有41種代謝通路,表2展示a～f代謝通路豐度值前15的結果。主要代謝通路有膜運輸、碳水化合物代謝、復制和修復、氨基酸代謝、翻譯、特征差和核苷酸代謝等。

其中,a～f碳水化合物代謝路徑豐度值占比分別為:14.97%、15.29%、14%、15.33%、15.19%、14.79%。有關研究表明:能夠代謝碳水化合物及酶活性種類最多的菌種是鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌,而植物乳桿菌碳水化合物利用能力和酶活性卻相對較少;乳酸桿菌對碳水化合物的代謝特征也可為特異性益生元的選擇提供參考[33]。a～f氨基酸代謝豐度值占比分別為:9.14%、8.74%、9.94%、8.68%、8.77%、9.09%。氨基酸經過不同的代謝途徑,在轉氨酶、裂解酶和脫氫酶等的作用下產生各種揮發性香氣成分[34]。

通過KEGG數據庫分析,a～f中共有780余種酶,表3是豐度均值前50的酶類。由表3看出乙醛脫氫酶/乙醇脫氫酶、醇脫氫酶等豐度均值較高,由此推測豆汁兒中的風味物質主要來源于氨基酸代謝。乳酸桿菌α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的轉糖基作用可用于生產益生元α-低聚半乳糖和β-低聚半乳糖[33]。β-半乳糖苷酶屬于糖苷水解酶,不僅能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖,而且能催化轉糖苷反應合成半乳糖寡糖(Galactooligosaccharide,GOS),GOS是一種雙歧因子,能促進腸道內雙歧桿菌增殖,對人類的健康有許多益處[35]。由表3可知,a～f中β-半乳糖苷酶豐度均值較高,由此推測在豆汁兒發酵過程中,乳桿菌目(Lactobacillales)的酶活性特征可促使β-低聚半乳糖及GOS的產生,益于腸道菌群健康。

表2 KEGG數據庫主要代謝通路豐度值Table 2 Abundance of main metabolic pathways in KEGG database

表3 KEGG數據庫主要酶豐度值Table 3 Abundance of main enzyme in KEGG database

3 結論

通過微生物多樣性檢測分析,微生物16S rDNA測序可以初步斷定:豆汁兒中乳桿菌目(Lactobacillales)占比95.8%以上,是優勢菌目;進一步分析(圖4所示)表明,乳桿菌屬(Lactobacillus)是豆汁兒中的優勢菌屬;食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)和沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)是優勢菌種(表1和圖5所示)。通過豆汁兒中乳桿菌目(Lactobacillales)的功能預測分析結果推測:豆汁兒中的風味物質來源于氨基酸代謝，發酵過程中產生β-低聚半乳糖及GOS,有益于腸道菌群健康。