籽瓜多糖提取工藝的響應面優化及其體外降血脂活性

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(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830000; 2.新疆農業科學院農產品貯藏加工研究所,新疆烏魯木齊 830000)

近些年來,心腦血管疾病已成為危害人類健康最嚴重的疾病之一,發病率呈逐年上升的趨勢,血脂濃度升高會增加心腦血管疾病患者的死亡率。通過飲食方式降低血脂濃度,預防心腦血管疾病的發生,引起了人們的廣泛關注[1-3]。因此,更為健康的天然物質的活性成分已經成為研究的熱點之一。已有研究證實,多糖的降血脂作用溫和,毒副作用小,對高脂血癥人群具有良好功效[4]。

多糖是由10個以上單糖分子通過糖苷鍵連接形成的天然高分子化合物,具有調節機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抗癌、抗菌、防輻射和降糖脂等生理活性[5-9]。多糖來源和提取方式的不同,其功能功效也有所不同。目前,對多糖的提取方法主要有溶劑提取法[10]、超聲輔助法[11]、微波輔助提取法[12]和酶提取法[13]等。與其它方法相比,超聲輔助法具有強烈的空化效應,增加溶劑穿透力,加快多糖溶出速度,既能提高提取率,又不破壞其生物活性。

籽瓜(Citrulluslanatussp.Convarvar.MegulaspemusL.),又名打瓜,主要分布于我國新疆、甘肅、東北及內蒙古東部等地區[14]。籽瓜是新疆重要的經濟作物之一,在農業產業結構調整中占有重要地位,種植面積有21萬公頃,產量已達30萬噸[15]。籽瓜主要是以取籽加工為主,瓜皮瓜瓤丟棄在田間,造成巨大的資源浪費和環境污染。籽瓜取籽加工后的副產物籽瓜汁、籽瓜瓤和籽瓜瓜皮的再利用,不僅能提高籽瓜的經濟價值,還能減少環境污染。如何提高籽瓜加工副產物的綜合利用率,增加附加值降低生產成本,是決定籽瓜加工業進一步提升的一個重要環節。因此,需要對籽瓜有益成分的提取和加工進行深入研究,評價籽瓜皮渣中有益成分的功能。籽瓜加工副產物中含有多糖、果膠、維生素、氨基酸等多種營養物質,其中籽瓜多糖的研究主要集中在抗氧化生物活性方面[16],降血脂活性的研究卻鮮有報道。研究籽瓜中的多糖降血脂活性,驗證籽瓜多糖的食藥作用是提高籽瓜加工副產物利用率的研究方向之一。

本文以新疆籽瓜為試材,優化籽瓜多糖超聲輔助的提取工藝,分析考察籽瓜多糖的降血脂作用,并與其他提取物的膽酸鹽結合試驗結果作比較,探討籽瓜多糖的降血脂效果,為籽瓜副產物精深加工和多糖的降血脂功效的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

籽瓜 2018年8月采摘于新疆昌吉籽瓜種植園;石油醚、無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸、鹽酸 天津市北聯精細化學品開發有限公司;胃蛋白酶(1∶3000)、胰蛋白酶(1∶250)、牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉 上海源葉生物科技有限公司。

KQ5200DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;LGJ-25C冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司;RE100-Pro旋轉蒸發儀 美國SCILOGEX公司;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;0DD150FL高效熱泵除濕干燥機 廣州晟啟能源設備有限公司;Centrifuge 5810R大容量離心機 艾本德公司;ML204/2電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2600型紫外-可見分光光度計 島津企業管理(中國)有限公司;THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 籽瓜干粉的制備 將籽瓜原材料去翠衣皮,切塊,去籽,留瓜瓤,經40 ℃低溫干燥48 h后粉碎,經100目篩網過濾得到籽瓜干粉。將籽瓜干粉按原料∶石油醚=1∶3 (W/V)的比例加入石油醚原液,室溫條件下浸泡12 h后,采用旋轉蒸發儀濃縮體積,回收石油醚。重復2次,除去脂溶性雜質,最后放入40 ℃烘箱內干燥,得到籽瓜干粉原料。

1.2.2 籽瓜多糖的提取工藝 參照文獻[17-19]的方法,略作修改。取1 g處理后的原料,以蒸餾水為溶劑,采用超聲波輔助提取。在實驗設定的溫度、時間、超聲功率等條件下提取籽瓜多糖。提取液于轉速為10000 r/min離心10 min,取上層清液于50 ℃旋轉蒸發儀中減壓濃縮至一定體積,加入4倍無水乙醇20 mL,醇沉24 h。8000 r/min離心10 min,取下層沉淀(白色絮狀物質),用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2～3次,Sevag法(正丁醇∶氯仿=1∶4)脫去蛋白,-60 ℃冷凍干燥得到籽瓜粗多糖。苯酚-硫酸法測定多糖含量,多糖得率計算公式如(1)式:

式(1)

1.2.3 籽瓜多糖提取單因素實驗

1.2.3.1 提取溫度對籽瓜多糖得率率的影響 固定超聲功率為500 W,以料液比為1∶30 g/mL,提取溫度分別為20、30、40、50、60 ℃的條件下提取2 h。平行提取3次,考察提取溫度對多糖得率的影響。

1.2.3.2 提取時間對籽瓜多糖得率的影響 以料液比為1∶30 g/mL,超聲功率為500 W、提取溫度為40 ℃的條件下,分別提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。平行提取3次,考察提取時間對多糖得率的影響。

1.2.3.3 料液比對籽瓜多糖得率的影響 以超聲功率為500 W,提取溫度為40 ℃,料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL的條件下提取2 h。平行提取3次,考察料液比對多糖得率的影響。

1.2.3.4 超聲功率對籽瓜多糖得率的影響 以料液比1∶30 g/mL,提取溫度為40 ℃,超聲功率分別為100、200、300、400、500 W的條件下提取2 h。平行提取3次,考察超聲功率對多糖得率的影響。

1.2.4 響應面優化試驗 在單因素優化試驗的基礎上以最優提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)、和超聲功率(D)為自變量,根據Box-Behnken設計原理[19],進行四因素三水平的響應面分析試驗。以籽瓜粗多糖得率為響應值,優化籽瓜多糖的提取工藝參數。因素水平設計見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素和水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.2.5 體外降血脂作用的研究

1.2.5.1 膽酸鹽標準曲線的繪制 參照文獻[20]的方法,略作修改,分別繪制甘氨膽酸鹽和牛磺膽酸鹽標準曲線。配制甘氨膽酸鈉標準溶液0、0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mmol/L,和牛磺膽酸鈉標準溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L。取不同濃度的標準溶液2 mL分別置于不同具塞試管中,每只試管加入6 mL質量分數60%的H2SO4溶液。之后于70 ℃水浴加熱20 min,取出放置冰浴5 min,在波長為387 nm處測定吸光度。以膽酸鹽濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標分別繪制甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉標準曲線圖。

1.2.5.2 膽酸鹽結合實驗 參照文獻[20]的方法,略作修改。分別移取3 mL質量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL籽瓜多糖溶液兩份于100 mL三角瓶中,每個三角瓶分別加入3 mL 10 mg/mL胃蛋白酶溶液和1 mL 0.01 mol/L的HCl溶液,在37 ℃的恒溫振蕩器內振蕩1 h(模擬胃消化環境),0.1 mol/L的NaOH溶液調節pH至6.3。隨后,加入4 mL 10 mg/mL胰蛋白酶溶液,37 ℃下恒溫振蕩器振蕩1 h(模擬腸道環境)。一份樣品三角瓶中加入4 mL 0.4 mmol/L甘氨膽酸鈉;另一份樣品三角瓶中加入4 mL 0.5 mmol/L牛磺膽酸鹽。在37 ℃的恒溫振蕩器內振蕩1 h,于4000 r/min離心20 min,取上清液,用比色法于387 nm處測定吸光度值,每個樣品平行測定3次,按照標準曲線計算剩余甘氨膽酸鹽和牛磺膽酸鹽含量,所加入甘氨膽酸鹽或牛磺膽酸鹽總量減去剩余量所得差值與總量的比值即為結合率,以百分比表示。計算公式如(2)(3)式:

式(2)

式中:c0為甘氨膽酸鈉加入量,μmol;c1為甘氨膽酸鈉剩余量,μmol。

式(3)

式中:c2為牛磺膽酸鈉加入量,μmol;c3為牛磺膽酸鈉剩余量,μmol。

1.3 數據處理

采用Excel 2010作圖表。使用SPSS 19.0軟件對數據進行方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取溫度對籽瓜多糖得率的影響 由圖1a可知,溫度對于籽瓜多糖的得率有著顯著(P<0.05)的影響。隨著溫度的上升,籽瓜多糖得率呈現先增加后下降的趨勢,當溫度為30～40 ℃時,籽瓜多糖得率隨溫度的上升，增加的趨勢最迅速,多糖得率在40 ℃時達到最大值,在一定范圍內,提取溫度的升高,有利于分子的運動和多糖的溶出;溫度過高則會影響到多糖的結構,會使多糖得率降低。因此選擇的最佳提取溫度為40 ℃。

2.1.2 提取時間對籽瓜多糖得率的影響 由圖1b可知,隨著提取時間的增加,籽瓜多糖的得率先升高后下降,在2.0 h時達到最大值。由于超聲波的空化效應增大,溶劑進入溶質內部的能力增強,較短時間內,超聲開始對細胞進行破碎,使得多糖更容易從細胞中釋放出來,使得整個提取時間縮短,得率增大。隨超聲時間的增長,多糖分子中的五碳環或六碳環可能裂解成為可溶于乙醇的寡糖、低聚糖或單糖,造成多糖在醇沉過程中溶解損失增加;此外,超聲波空化效應作用力減小,會影響多糖溶出。這些因素都會導致多糖得率的下降[21-22]。比較分析消耗能量、浸提時間和原料浪費等各種因素,選擇的提取時間為2.0 h。

2.1.3 料液比對籽瓜多糖得率的影響 由圖1c可知,多糖得率隨料液比的增大呈現先上升后下降的趨勢，在料液比為1∶30 g/mL時，多糖得率最大。這可能是溶劑體積的增加使得溶液中多糖濃度下降,多糖分子擴散的壓力差增大,有利于多糖分子的擴散和溶出。當多糖的擴散量達到一定的值時,繼續加大溶劑比例,也不會使更多多糖擴散[23]。并且料液比增大,可能會致使后續的提取濃縮過程中隨時間增加,多糖損失升高,導致多糖得率下降。因此,選擇料液比為1∶30 g/mL。

2.1.4 超聲功率對籽瓜多糖得率的影響 由圖1d可知,多糖得率的變化隨著超聲波功率的增大呈現先增加后緩慢降低至平穩的趨勢。當提取功率為200 W時多糖得率最大,隨著超聲功率的繼續增加,多糖得率基本保持不變。這是因為隨超聲功率增大，超聲的空化作用隨之加強,細胞破裂多糖加速溶出;當超聲波功率增大到一定值時,多糖得率不會再增加基本保持不變[24]。因此,選擇適宜超聲波功率為200 W。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果及方差分析 通過單因素實驗發現:在提取過程中提取溫度為40 ℃,提取時間為2.0 h,料液比為1∶30 g/mL,超聲功率為200 W時,籽瓜粗多糖得率最大。如表2所示,將提取溫度、提取時間、料液比和超聲功率作為研究的對象,籽瓜粗多糖得率為響應值,共得到29個實驗點,利用Design-Expert 10.0軟件對數據進行多元回歸擬合,確定籽瓜粗多糖得率對以上因素的二次多項回歸模型為:

Y=5.98+0.17A+0.26B+0.45C+0.45D-0.017AB-0.12AC-0.12AD-0.010BC-5.000E-003BD-0.03CD-0.51A2-0.21B2-1.79C2-0.089D2

圖1 提取溫度(a)、提取時間(b)、料液比(c)和超聲功率(d)對多糖得率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature(a),extract times(b),ratios of material to water(c)and ultrasonic power(d)on the yield of polysaccharide

表2 籽瓜粗多糖提取響應分析方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

采用超聲輔助提取籽瓜多糖的回歸數學模型進行方差分析,檢驗方程的有效性和各因子的偏回歸系數,回歸模型的方差分析如表3所示。通過統計學分析可知,該試驗選用的模型極顯著(P<0.0001),方差的失擬項不顯著(P=0.0559>0.05),所選模型的R2為0.9950,說明模型的選擇是合適的,可用于超聲輔助提取籽瓜多糖的分析與預測。同時,表3結果還顯示,在本試驗設計中:A、C項為高度顯著(P<0.0001),AC、AD項為顯著項(P<0.05),A2、B2、C2項均為高度顯著項(P<0.0001),D2項為顯著項(P<0.05)。

表3 次多項式回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance the regression model

注:*表示P<0.05,差異顯著;**表示P<0.01,差異極顯著;***表示P<0.001,差異高度顯著。

2.2.2 響應面分析 如圖2所示,由曲面的分析可預測、檢驗確定變量和響應值之間的相互關系,響應面越陡峭,表現出各個因素之間的兩兩交互作用越顯著[25-26]。提取溫度和料液比交互作用顯著。

圖2 各因素交互作用的響應面Fig.2 Response surface of interaction of various factors

2.2.3 最佳提取工藝驗證 根據響應面結果,得到的最佳提取工藝條件是:提取溫度為41.318 ℃、提取時間為2.039 h、料液比為1∶30.078 g/mL、超聲功率為216.750 W。考慮到實際情況對上述條件加以修正,最終的優化條件為提取溫度為42 ℃、提取時間為2 h、料液比為1∶30 g/mL、超聲功率為220 W,在該參數下,進行3組平行實驗,所得多糖得率平均值為6.03%,與理論預測值的6.024%相近,說明該回歸方程能較準確反應各因素對籽瓜多糖提取率的影響,證明采用響應面法優化籽瓜多糖提取率回歸模型可行。

2.3 籽瓜多糖體外降血脂能力分析

2.3.1 甘氨膽酸鹽和牛磺膽酸鹽標準曲線 由圖3a和圖3b可知:甘氨膽酸鹽標準曲線回歸方程為:y=2.8655x+0.0212,R2=0.9991,線性關系良好;牛磺膽酸鹽標準曲線回歸方程為:y=2.4664x+0.0126,R2=0.9990,線性關系良好。

圖3 膽酸鹽標準曲線(a)與牛磺膽酸鹽標準曲線(b)Fig.3 Tandard curve of glycine sodium cholate(a) and taurine sodium cholate(b)

2.3.2 籽瓜多糖對膽酸鹽的結合能力 從圖4可以看出,籽瓜多糖與牛磺膽酸鈉的結合量比與甘氨膽酸鈉的結合量多,即籽瓜多糖與牛磺膽酸鹽的結合能力更強,并且與二者的結合量均隨多糖濃度的增加而升高。當籽瓜多糖的濃度達到2.5 mg/mL時,籽瓜多糖和甘氨膽酸鹽、牛磺膽酸鹽的結合率分別達到62.67%和69.27%。證實籽瓜多糖具有較好的體外降血脂活性。隨著繼續增加籽瓜多糖的量,結合率的上升變得緩慢;當籽瓜多糖濃度達到3.5 mg/mL時,籽瓜多糖與甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉的結合率分別達到66.17%和70.27%。但僅是籽瓜濃度為2.5 mg/mL時結合率的1.06倍和1.01倍。

圖4 籽瓜多糖對膽酸鹽結合能力Fig.4 Capacity of polysaccharide from seed melon to bind sodium cholate

粗多糖中較高的膽酸結合能力是由于糖蛋白與多糖形成復雜的結構,有利于結合膽酸[27]。籽瓜多糖的濃度為2.5 mg/mL時,與兩種膽酸鈉鹽的結合率明顯高于4 mg/mL的黑木耳多糖[28],也略高于3.5 mg/mL桑葉茯磚茶多糖[29]和4 mg/mL裙帶菜孢子多糖[30]與兩種膽酸鈉鹽的結合率。說明低濃度的籽瓜多糖有很好的體外降血脂活性,可作為具有潛在價值的降血脂保健食品原料。然而它與茶樹花渣乙醇萃取物[31]相比較,兩種膽酸鈉鹽的結合率卻略低。籽瓜多糖是以籽瓜廢棄的瓜瓤作為原材料,采用水作為溶劑,提取成本較低。因而選取籽瓜為原材料制備的籽瓜多糖,會大大降低成本,提高籽瓜加工附加值。

3 結論

本實驗中篩選出最佳提取工藝條件為提取溫度為42 ℃、提取時間為2 h、料液比為1∶30 g/mL、超聲功率為220 W。經實驗驗證,3次平行實驗求得平均得率為6.03%,與理論預測值較接近。

體外降血脂結果可以得出:當籽瓜多糖濃度達到2.5 mg/mL時,籽瓜多糖與甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉的結合率分別達到62.67%和69.27%。與其他提取物和兩種膽酸鈉鹽的結合率做對比,低濃度籽瓜多糖有很好的降血脂效果,可以作為一種植物源降血脂保健藥物,這一發現為籽瓜資源的利用提供了新的研究思路,也為籽瓜在醫藥食品行業開發奠定一定的理論基礎。