藜蒿莖抑制黃嘌呤氧化酶活性成分提取條件優(yōu)化及其成分分析

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(1.南昌大學，食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047; 2.南昌大學食品學院,江西南昌 330031; 3.南昌大學，中德食品工程中心,江西南昌 330047)

在生物體中存在黃素蛋白酶——黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD),能夠催化體內的底物黃嘌呤與次黃嘌呤形成尿酸,長期的嘌呤代謝紊亂可能會引起生物體內尿酸生成增多或尿酸排泄減少,體內尿酸濃度升高容易導致高尿酸血癥,進一步可引起痛風發(fā)作[1],根據統(tǒng)計約有5%～12%的高尿酸血癥最終可發(fā)展為痛風[2-3]。研究表明,痛風不但可以引起骨頭和關節(jié)上的疾病,而且還與肥胖、高血脂、高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病密切相關[4-6],已被聯合國列為21世紀20大頑癥之一[7]。XOD是催化黃嘌呤和次黃嘌呤代謝產生尿酸的關鍵酶,而黃嘌呤氧化酶抑制劑(Xanthine Oxidase Inhibitor,XOI)能同XOD結合,降低次黃嘌呤或黃嘌呤生成尿酸的速率,抑制尿酸生成。傳統(tǒng)的抗痛風藥物如別嘌醇、非布索坦通過抑制XOD活性達到治療效果,但存在較大的毒副作用[8-9]。苯溴馬隆等通過促進尿酸的排泄來達到降尿酸的作用[10],但這些藥物常常伴隨有皮疹、發(fā)熱等副作用。因此開發(fā)安全性高的天然黃嘌呤氧化酶抑制劑具有實際意義。

藜蒿(ArtemisiaselengensisTurcz.)為菊科蒿屬植物,自古以來就是一種既可供食用又可入藥的時令性野生蔬菜,現代研究發(fā)現,藜蒿具有抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、抑菌[13]、降壓[14]等作用,但對于藜蒿提取物抑制XOD活性,緩解高尿酸血癥的研究報道較少。李思慧等[15]檢測了24種蔬菜(藜蒿、香菜、芽白秧、生菜等)醇提物對XOD的抑制作用,同等劑量下藜蒿提取物的抑制率最高,動物實驗中也發(fā)現藜蒿提取物具有較強降尿酸作用,并能抑制肝臟XOD的活性。藜蒿主要食用部分為莖而非葉,本研究以藜蒿莖中具XOD抑制能力的成分為研究對象,通過單因素實驗和響應曲面試驗,確定最優(yōu)的提取條件,液質聯用分析確定提取液中主要成分,為研究開發(fā)可調節(jié)尿酸水平的食品功能成分提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮藜蒿 采自江西省南昌市新建區(qū)南磯鄉(xiāng);次黃嘌呤(HPLC純度99%)、別嘌醇(HPLC純度98%)、甲醇(色譜級)、甲酸(色譜級) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;黃嘌呤氧化酶(X1875-25UN) 美國Sigma公司;對照品綠原酸(3-CQA)、新綠原酸(5-CQA)、異綠原酸b(3,4-diCQA)、異綠原酸a(3,5-diCQA)、1,5-二咖啡酰基奎寧酸(1,5-diCQA)和異綠原酸c(4,5-diCQA) 純度≥98%,上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;氫氧化鈉、鹽酸、焦磷酸鈉、無水乙醇 分析純,西隴化工股份有限公司。

DFY-500粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;HJ-40磁力攪拌水浴鍋 金壇市良友儀器有限公司;FA1604分析電子天平、UV-7504紫外分光光度計 上海精密科學有限公司;SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵、RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;安捷倫6430超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜儀 上海安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜蒿莖抑XOD活性成分的提取 將新鮮藜蒿葉、莖分離,洗凈,切段,取藜蒿莖在60 ℃烘箱干燥,粉碎,過60目篩,置于干燥器內保存?zhèn)溆谩７Q取藜蒿莖干粉末5 g于圓底燒瓶中,在一定的乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時間、提取次數下進行乙醇回流提取,提取結束后,將提取液過濾,去除濾渣,得到的濾液轉移至旋轉蒸發(fā)儀中,50 ℃旋蒸濃縮至無醇味,最終用蒸餾水定容至100 mL。每個實驗做三組平行樣。

1.2.2 單因素條件的確定

1.2.2.1 乙醇濃度 取乙醇濃度分別為0%、20%、40%、60%、80%,液料比10∶1 mL/g,在80 ℃水浴提取2 h,提取1次。將提取液檢測抑制XOD活性,確定效果最好水平。

1.2.2.2 液料比 乙醇濃度參照1.2.2.1,取液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1 mL/g,在80 ℃水浴提取2 h,提取1次。將提取液檢測抑制XOD活性,確定效果最好水平。

1.2.2.3 提取溫度 乙醇濃度參照1.2.2.1,液料比參照1.2.2.2,取水浴溫度分別為40、60、80、100 ℃,提取2 h,提取1次。將提取液檢測抑制XOD活性,確定效果最好水平。

1.2.2.4 提取時間 乙醇濃度參照1.2.2.1,液料比參照1.2.2.2,水浴溫度參照1.2.2.3,取提取時間1、2、3、4 h,提取1次。將提取液檢測抑制XOD活性,確定效果最好水平。

1.2.2.5 提取次數 乙醇濃度參照1.2.2.1,液料比參照1.2.2.2,水浴溫度參照1.2.2.3,提取時間參照1.2.2.4,取提取次數1次、2次、3次。將提取液檢測抑制XOD活性,確定效果最好水平。

1.2.3 響應曲面優(yōu)化 根據單因素實驗結果,采用Box-Behnken中心試驗優(yōu)化設計,選擇乙醇濃度、液料比以及提取溫度為三個考察因子。響應面試驗設計因素及水平表,見表1。

表1 響應面試驗設計三因素三水平表Table 1 Response surface test design of three factors and three levels

1.2.4 抑制XOD活性的測定 參照文獻[16],按實驗情況改動,在有氧條件下使用紫外分光光度法測量XOD活性,反應混合物由200 mmol/L焦磷酸鈉緩沖液(pH=7.5)400 μL、0.6 mmol/L次黃嘌呤200 μL、樣品20 μL、蒸餾水180 μL和0.1 U/mL黃嘌呤氧化酶(XOD)200 μL組成。將反應體系混合除次黃嘌呤外在37 ℃下水浴0.5 h,最后用次黃嘌呤啟動反應。隨后在波長295 nm處測量一定的時間內尿酸的生成(吸光度變化)速率。計算公式為:

抑制率R(%)=(1-b/a)×100

其中,a:無樣品吸光度隨時間的變化率;b:樣品存在下吸光度隨時間的變化率。

1.2.5 藜蒿莖提取液的主要成分分析 稱取藜蒿莖干粉末5 g于圓底燒瓶中,按響應曲面優(yōu)化的最佳提取條件,加170 mL 53%的乙醇溶液,79 ℃乙醇回流提取1 h,提取次數為2次。提取結束后,將提取液過濾,去除濾渣,得到的濾液轉移至旋轉蒸發(fā)儀中,50 ℃旋蒸濃縮至無醇味,最終用蒸餾水定容至100 mL。移取2 mL,過0.22 μm濾膜后,置于進樣瓶中。

色譜條件:UPLC色譜柱:Shim-pack GIST C18(2.1×75 mm,2 μm),流動相A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈;洗脫梯度:0～15 min,10%～25% B;15～25 min,25%～35% B;25～30 min,35%～40% B;30～35 min,40% B;35～36 min,40%～10% B;36～40 min,10% B,進樣量為5 μL,柱溫為室溫,流速0.3 mL/min。

質譜條件:Hybrid Quadrupole-TOF LC/MS/MS Mass Spectrometer:TripleTOF 5600+(AB Sciex);ESI源;負離子檢測模式;CUR:35.000 psi;GS1:50.000 psi;GS2:50.000 psi;ISVF:-4500.000 V;TEM:550.000 ℃;一級(Start Mass:100.0;End Mass:1000.0;CE:-10.000 V;DP:-80.000 V);二級(IDA模式,Start Mass:50.0;End Mass:1000.0;CE:-30±15.000 V;DP:-80.000 V)。

1.3 數據處理

所有數據為3次重復實驗的平均值,結果表示為平均值±標準差。所有實驗數據用Origin2017作圖,響應面用Design Expert 8.0軟件設計。

2 結果與分析

2.1 藜蒿莖抑XOD活性成分提取單因素條件的確定

2.1.1 乙醇濃度的確定 由圖1可知,隨著乙醇濃度的增加,藜蒿莖提取液的XOD抑制率增加,且XOD抑制率在乙醇濃度60%時達到最大,之后再提高乙醇濃度,XOD抑制率有所下降。這可能是由于活性成分的溶解特性因溶劑極性不同而有所差異,隨著乙醇濃度增加,活性成分與乙醇溶劑的極性越來越接近,提取液中溶出的活性成分含量增加,但乙醇濃度超過60%后,極性差異變大,影響活性成分的提取效果[17],XOD抑制率因此受到影響而下降。確定60%為最佳的乙醇濃度。

圖1 乙醇濃度對XOD抑制率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on XOD inhibition rate注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖2～圖5同。

2.1.2 液料比的確定 由圖2可知,隨著提取試劑乙醇比例的增多,藜蒿莖提取液的XOD抑制率增加,主要是因為提取溶劑用量越多,增加了料與液的接觸面積,提高溶質擴散速率,從而使XOD抑制成分提取得率增加。當液料比達到40∶1 (mL/g)時,XOD抑制率達到最大,但由圖2可以看出,當液料比在30∶1～40∶1之間時,XOD抑制率差異不顯著,綜合考慮經濟適用性,確定30∶1為最佳液料比。

圖2 液料比對XOD抑制率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on XOD inhibition rate

2.1.3 提取溫度的確定 由圖3可知,隨著提取溫度的升高,藜蒿莖提取液的XOD抑制率增加,且XOD抑制率在提取溫度為80 ℃時達到最大,之后再提高提取溫度,XOD抑制率有所下降，但并不顯著。原因可能是溫度升高,增加了細胞膜的流動性,同時原料中的化合物擴散速率也加快,更多的活性物質被提取出來,從而增加了XOD抑制率[18]。但溫度過高,部分化合物的穩(wěn)定性也會受影響,所以確定80 ℃為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對XOD抑制率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on XOD inhibition rate

2.1.4 提取時間的確定 由圖4可知,提取時間對藜蒿莖提取液的XOD抑制率影響無顯著差異,1 h到4 h提取液的酶抑制率幾乎相同。原料與提取溶劑接觸時間足夠充分,原料組分不斷從原料中擴散出來,但是當大部分的原料組分都通過擴散溶解到提取溶劑中后,繼續(xù)延長提取時間,XOD抑制率無明顯變化。故后續(xù)實驗的提取時間選定為1 h。

圖4 提取時間對XOD抑制率的影響Fig.4 Effect of extraction time on enzyme XOD rate

2.1.5 提取次數的確定 由圖5可知,隨著提取次數的增加,藜蒿莖提取液的XOD抑制率增加,且XOD抑制率在提取次數為2次時達到最大,之后再增加提取次數,XOD抑制率無顯著差異。提取次數的增加,使得第一次提取時未溶出活性物質能被提取出來,所以增大了XOD抑制率。但2次提取和3次提取的提取液XOD抑制率幾乎不變,原因可能是2次提取可使活性物質基本全部溶出,第3次提取時幾乎沒有新溶出的活性物質。故后續(xù)實驗的提取次數選定為2次。

表3 回歸模型系數顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significance testing and variance analysis of model regression coefficients

注:*顯著(P<0.05),**極顯著(P<0.01)。

圖5 提取次數對XOD抑制率的影響Fig.5 Effect of extraction times on XOD inhibition rate

2.2 響應曲面優(yōu)化提取條件

在單因素實驗基礎上,以A乙醇濃度、B液料比和C提取溫度3個因素為影響因素,以XOD抑制率為響應值設計3因素3水平試驗。響應面試驗設計及結果,見表2。由表2可得以XOD抑制率為響應值的回歸方程:R=+58.66+0.4A+1.99B-0.36C+0.67AB+0.23AC+0.50BC-2.51A2-1.33B2-2.08C2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 The experimental results of response surface design

由表3可知,模型的Prob>F為0.0132(P<0.05),表明該模型具有顯著性。此外,模型的失擬項值為0.7177(P>0.05),不顯著,說明模型選擇較合適,實驗的相對誤差較小,可以用此模型對XOD抑制率進行分析和預測。一次項中B項極顯著(P<0.01),二次項中A2極顯著(P<0.01),C2顯著(P<0.05),兩兩因素之間交互作用不顯著。各因素對XOD抑制率的影響大小依次為液料比>乙醇濃度>提取溫度。

圖6為各因素交互作用的響應面及等高線圖。響應曲面圖以及等高線圖都可以反應兩個因素間相互作用的強弱。在響應面分析圖中,響應曲面的陡峭程度越大,說明相應的交互作用對XOD抑制率的影響越顯著,響應曲面的陡峭程度越平緩,相應的交互作用越弱。同樣,等高線越密集表示兩個因素交互作用越強,等高線稀疏則相反。由響應面和等高線可知,乙醇濃度與液料比、乙醇濃度與提取溫度以及液料比與提取溫度的交互作用均不顯著,這與表3中交互項AB、AC、BC的P值的分析結果保持一致。

圖6 各因素交互作用的響應面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effect of various reaction conditions

根據響應面分析建立的數學模型,得到最佳提取條件為乙醇濃度為53.98%,提取溫度為79.51 ℃,液料比為35.85∶1 (mL/g),在此條件下酶抑制率預測值為57.988%。根據驗證試驗結果,當乙醇濃度為53%,提取溫度為79 ℃,液料比為34∶1 (mL/g)時,平均酶抑制率達到56.4%±1.8%,實際測量值與預測值的相對標準偏差RSD為1.4%,說明所建模型與實際情況擬合很好。

表4 藜蒿莖提取液組分保留時間和質譜數據Table 4 Retention time and mass spectral data of extract of Artemisia selengensis Turcz stems

2.3 藜蒿莖提取液組分液質定性分析

如圖7、圖8所示,根據藜蒿莖提取液組分各峰的一級質譜圖可以看出,1、2號峰[M-H]-為m/z 353,3、4、5、6號峰[M-H]-為m/z 515,再結合相對應的二級質譜圖中的碎片離子峰,可以初步推斷出1、2號峰為單咖啡酰基奎寧酸,3、4、5、6號峰為二咖啡酰基奎寧酸。根據保留時間1號峰5.29 min,2號峰10.38 min,3號峰為25.03 min,4號峰為26.17 min,5號峰為27.06 min,6號峰為29.78 min,對比混合對照品的總離子流圖和質譜圖,確認1、2、3、4、5、6號峰分別為新綠原酸、綠原酸、異綠原酸b、異綠原酸a、1,5-二咖啡酰基奎寧酸、異綠原酸c,具體參數列于表4。Li等[19]從藜蒿葉中提取得到含有綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸b、異綠原酸a、異綠原酸c、萊薊素的提取物,并且這六種綠原酸類物質在體外都有一定的抑制黃嘌呤氧化酶的效果。Zhang等[20]在微波提取的藜蒿液中發(fā)現了三種單咖啡酰基奎寧酸與四種二咖啡酰基奎寧酸,分別為1-咖啡酰基奎寧酸,新綠原酸、綠原酸、異綠原酸b、異綠原酸a、1,5-二咖啡酰基奎寧酸、異綠原酸c,其中綠原酸的含量最高,其次為1,5-二咖啡酰基奎寧酸與異綠原酸a。本實驗研究結果與Li及Zhang等的結果相似,但未檢出萊薊素與1-咖啡酰基奎寧酸,原因可能是所使用的原料來源不同,成分的種類和含量略有差異。

圖7 綠原酸混合對照品的總離子流圖Fig.7 Total ion chromatogram of chlorogenic acid mixed controls注:A:新綠原酸;B:綠原酸;C:異綠原酸b;D:異綠原酸a; E:1,5-二咖啡酰基奎寧酸;F:異綠原酸c。

圖8 藜蒿莖提取液的總離子流圖Fig.8 Total ion currents of extract of Artemisia selengensis Turcz stems

3 結論

本文在單因素實驗結果的基礎上,采用響應曲面法優(yōu)化藜蒿莖中抑制XOD活性成分的提取條件。最佳提取條件為:乙醇濃度為53%,提取溫度為79 ℃,液料比為34∶1 (mL/g)。在此條件下進行驗證實驗,得到的提取液對XOD抑制率為56.4%,與預測值57.988%非常接近,實際測量值與預測值的相對標準偏差RSD為1.4%。利用液質聯用定性分析發(fā)現藜蒿莖提取液主要含有新綠原酸、綠原酸、異綠原酸b、異綠原酸a、1,5-二咖啡酰基奎寧酸和異綠原酸c。對于藜蒿莖抑XOD的有效成分定量與純化分離有待進一步的研究。