體外模擬亞硝化體系中優選阻斷NDMA生成的香辛料精油復合抑制劑

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(1.天津農學院食品科學與生物工程學院,天津 300384; 2.天津農學院動物科學與動物醫學學院,天津 300384; 3.天津農學院水產學院,天津 300384)

亞硝酸鹽通常作為發色劑、抑菌劑和抗氧化劑廣泛應用于腌肉制品的加工中[1-2]。亞硝酸鹽是N-亞硝胺類化合物的前體物,它極易可能與肉制品加工中所存在的二級胺反應生成N-亞硝胺[3-5]。N-亞硝胺是世界上公認的三大強致癌物質之一,也是四大食品污染物之一[6-7]。隨著食品工業的迅速發展,消費者“保健、回歸自然”的飲食意識不斷加強,對食品的安全性也越來越重視,食品中的N-亞硝胺類化合物的污染問題也備受關注[8-10]。

目前抑制N-亞硝胺形成的研究主要集中于提高亞硝酸鹽的清除率和阻斷N-亞硝胺形成這兩個方面[11-12]。張平等[13]確定了5.03 g的生姜提取物可以清除1 μg的亞硝酸鹽。周鳳超等[14]在亞硝酸鹽的清除試驗中研究得出,當加入的花椒、丁香和桂皮提取物分別為10 mL時,亞硝酸鹽清除率分別為67.56%、63.22%和65.13%;同時得出,10 mL的丁香提取物對N-亞硝胺的阻斷率為78.19%,強于同體積的花椒(30.52%)、桂皮(39.80%)和大蒜(25.41%)。李利華[15]在對亞硝酸鹽清除試驗中,研究得出四種不同溶劑的胡椒提取物皆具有較好的清除作用。以上研究均是單一香辛料對N-亞硝胺的阻斷作用,但是如何從眾多的香辛料中篩選出阻斷N-亞硝胺效果較好的香辛料,再將它們按一定比例配合形成復合抑制劑,起到提高肉制品風味與阻斷肉制品中N-亞硝胺形成的雙重作用的研究報道較少。

二次回歸正交組合設計,是在因子空間中選擇適當的試驗點,以較少的試驗處理建立一個有效的多項式回歸方程,從而解決生產中最優化問題的一種實驗設計方法,目的是尋找試驗指標和各因子間的定量規律[16]。本研究采用單因素和二次回歸正交組合設計相結合的方法,擬構建出胡椒、姜汁、花椒、八角、丁香5種香辛料精油的回歸模型及其最優配比,為后期開發安全、美味的肉類產品香辛料組合提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市售常用的9種香辛料精油(胡椒、姜汁、蒜汁、花椒、桂皮、八角、丁香、小茴香、孜然) 天津頂興食品有限公司;乳化劑(PEG8000)、檸檬酸鈉、鹽酸、α-萘胺、無水乙醇、無水對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、二甲胺鹽酸鹽、碳酸鈉 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

STARTER3100酸度計 美國OHAUS公司;18Basic勻漿機 德國IKA公司;XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋 上海科恒實業發展有限公司;NO.NU-425-400E超凈工作臺 天美(中國)科學儀器有限公司;T6新世紀型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 體外模擬亞硝化乳化體系的制備 參照馬儷珍等[17]的方法,并稍作修改。分別吸取不同體積的不同香辛料精油至相對應的50 mL的帶螺帽的離心管內,各加入0.05 g PEG8000,再加入一定體積的0.5 mol/L pH3.0 的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液,使其總體積為10 mL。用勻漿機B擋(13000 r/min)乳化處理后,取1 mL配制好的乳液至50 mL的帶螺帽的離心管內,加入0.5 mol/L pH3.0 的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液5.0 mL,加入1 mmol/L的亞硝酸鈉0.5 mL,再加1 mmol/L的二甲胺鹽酸鹽0.5 mL,再加入3 mL的緩沖液,使反應體系的總體積為10 mL,在37 ℃下水浴反應1 h。

1.2.2 NDMA的測定方法 按照1.2.1體外模擬亞硝化反應結束后,參照馬儷珍等[17]的方法,取1.0 mL反應的溶液至玻璃試管中,加入0.5 mL 質量分數0.5%的碳酸鈉溶液終止反應,將其置于15 W 紫外燈下照射15 min,液面距燈高為15 cm,取出后立即依次加入質量分數1%的對氨基苯磺酸1.5 mL(搖勻)和質量分數0.1%的α-萘胺1.5 mL(搖勻),再加緩沖液至溶液體積精確為5.0 mL,搖勻,靜置15 min 顯色后在波長525 nm比色測定其吸光度。

1.2.3 單因素實驗 研究不同體積濃度的不同香辛料精油乳液對NDMA的抑制率。按1.2.1的方法分別吸取9種香辛料精油0.00、0.05、0.50、1.00、1.50、2.00 mL,使每種香辛料精油在體外模擬亞硝化反應中的終濃度分別為0.0、0.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mL/L(表示每L體外模擬亞硝化反應體系中含有各種精油的mL數),反應結束后,按1.2.2進行NDMA的測定,空白對照組為不加香辛料精油的空白乳液,計算每一種香辛料精油在對應體積濃度時的抑制率,并進行分析,試驗均重復3次。

表1 5因素二次回歸正交組合設計水平取值及編碼表Table 1 Combination design level value and coding of 5-factor quadratic regression orthogonal

將x1、x2、x3、x4、x5依次安排在常用正交表L16(215)的第1、2、4、8、15列上,將列中的數字2改成-1;加入10個星點號(軸點)和6個中心點獲得五因素二次回歸正交組合設計[21]。

1.2.5 驗證試驗 按照1.2.4將二次回歸正交組合設計得出的香辛料精油的最優配比添加到體外模擬NDMA形成的體系中,試驗重復6次進行驗證。

表2 9種不同濃度香辛料精油添加對NDMA抑制效果(%)Table 2 Inhibition effects of N-dimethylnitrosamines in different volume concentrations of 9 spices(%)

注:結果表示為平均值±標準偏差(n=3);同一行不同大寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

1.3 數據處理

運用SigmaPlot 10.0軟件作圖,采用SPSS 17.0軟件對數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)。選擇Duncan’s多重分析法檢驗組間顯著性,顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

9種香辛料精油添加濃度不同對NDMA抑制率變化見表2。由表2可以看出,9種香辛料精油對NDMA的形成均有不同抑制效果。其中,丁香精油對NDMA的抑制率最強,丁香精油的體積濃度在0.5 mL/L時,對NDMA的抑制率為62.05%,體積濃度為5.0 mL/L時,對NDMA抑制率可升高至76.81%,當濃度繼續升高至15.0 mL/L時,抑制作用并沒有顯著增強(P>0.05);其次胡椒、花椒和八角精油對NDMA的抑制性也較強,體積濃度為5.0 mL/L時,對NDMA抑制率均在65.0%以上,當體積濃度再繼續增加時,抑制作用保持在70.93%～74.07%范圍;而桂皮和孜然精油體積濃度升高至10.0 mL/L時,對NDMA的抑制率才分別達到66.14%和64.79%;小茴香精油濃度為15.0 mL/L時,對NDMA的抑制作用才能達到61.21%;姜汁和蒜汁精油對NDMA的抑制率最弱,隨著濃度的增加僅呈現平緩的增加趨勢,當濃度升高至最高20 mL/L時,抑制率也僅為37.19%和36.07%。

由表2可知,胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香達到最高抑制率時的體積濃度分別為15.0、15.0、15.0、10.0和5.0 mL/L,但由于香辛料精油風味醇香濃厚,最終確定5種香辛料精油復配時的體積濃度為單因素實驗抑制率相對較高的對應體積濃度的1/5,雖然胡椒和八角達到最高抑制率時的體積濃度為15.0和10.0 mL/L,但是胡椒屬于辛辣型[22],八角在肉制品的加工中又有一定的應用價值[23],而丁香精油由于其香氣濃郁,其體積濃度為胡椒的1/10,所以最終確定在二次回歸組合試驗設計中胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香零水平的體積濃度為2.0、3.0、3.0、3.0和0.20 mL/L。

由此可知,單一使用某一種香辛料精油要達到較高的濃度(5.0 mL/L以上,丁香精油除外)才能對NDMA的抑制率達到60%以上,然而在實際應用中要考慮到產品的風味,不可能添加如此高的濃度,所以我們選擇對NDMA抑制效果較好的丁香、胡椒、花椒和八角精油以較低濃度進行復配,另外考慮到生姜精油在實際應用中所起到的去腥、去異味等特殊作用,盡管它對NDMA的抑制率低,也考慮對其進行進一步優選。

2.2 二次回歸正交試驗

2.2.1 二次回歸正交試驗結果的統計 在單因素實驗的基礎上,運用二次回歸正交組合設計(1/2)進行試驗,得出的計算結果如表3所示。

2.2.2 回歸模型的建立與檢驗

2.2.2.1 偏回歸系數的顯著性檢驗 回歸關系方差分析見表4。回歸關系達到極顯著水平,說明回歸方程擬合度良好,R2=0.955,說明本試驗設計的因素、水平選擇是成功的。

表3 5因素二次回歸正交組合設計結構矩陣及計算表Table 3 Structure matrix and calculation of 5-factor quadratic regression orthogonal combination design

2.2.2.2 回歸方程的失擬性檢驗 由表4可得,擬合度F檢驗為:FLf=4.95,失擬檢驗不顯著,說明該方程擬合度較好,且此回歸方程在此試驗中有一定意義。

式(1)

y=61.730+0.293x2+2.339x3+0.588x5-0.506x1x4-0.272x3x4-0.540x21-0.681x22-0.963x23-0.681x24-0.916x25

式(2)

式(3)

2.2.3 效應分析

2.2.3.1 主效應分析 由于數據進行了中心化處理,消除了量綱上的差異,可直接根據回歸系數絕對值的大小來分析各種精油對NDMA抑制效果的影響[25-26]。由回歸方程(1)可知,各回歸系數絕對值的大小依次為b3>b5>b2>b1>b4,說明花椒精油和丁香精油對NDMA的抑制效果較好。

圖1 單因素與NDMA抑制率的關系Fig.1 Relationship between single factor and NDMA inhibition rate

表4 回歸關系方差分析表Table 4 Regression and variance analysis

由圖1可知,各編碼變量在-1.820～1.820取值范圍內,5個編碼因素與NDMA抑制率的關系曲線均呈現出先上升后下降的趨勢。其中,胡椒精油(Z1)、姜汁精油(Z2)、八角精油(Z4)和丁香精油(Z5)4種香辛料精油在編碼變量-1.820≤X≤0的取值范圍內時,編碼值與NDMA抑制率呈正相關;在編碼變量0≤X≤1.820的取值范圍內,則反之;且這4種香辛料精油在編碼變量為0時,NDMA的抑制率有最大值。而花椒(Z3)則在編碼變量為1時,NDMA的抑制率有最大值[28-29]。

2.2.3.3 因素間交互效應分析 由表4可知,對回歸方程偏回歸系數進行顯著性檢驗,b14在α=0.5水平上有顯著性差異,表示x1(胡椒精油)與x4(八角精油)之間存在明顯的交互作用;b34雖然在α=0.25水平上沒有顯著性差異,但x3(花椒精油)與x4(八角精油)之間的交互作用相比于其他因素之間較為顯著[30-31]。

2.3 優化試驗結果

利用數學求極值的方法,對回歸方程(2)求一階偏導數,尋找所得到的五元二次回歸方程的局部最優解。對所建立的編碼回歸方程,先求其關于5個編碼變量的一階偏導并令其等于零[32]。用Excel解方程組得到x1=0.142、x2=0.215、x3=1.258、x4=-0.303、x5=0.321時,Y有極大值;各因素Z1=2.078、Z2=3.118、Z3=3.692、Z4=2.833、Z5=0.218,即添加胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香的體積濃度分別為2.078、3.118、3.692、2.833、0.218 mL/L時,由回歸方程得出抑制率的理論值為63.327%。

2.4 驗證實驗結果

在體外模擬亞硝化反應體系中添加胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香,添加量分別為2.078、3.118、3.692、2.833、0.218 mL/L,結果表明,香辛料精油的加入對NDMA的抑制率為64.412%±0.25%,與理論值63.327%相當,說明得到的二次回歸方程與實際的擬合效果較好。

3 討論

本試驗采用二次回歸正交組合設計得到的最優配比,對NDMA的抑制率(驗證試驗值64.412±0.25%)比單因素試驗中最高的NDMA抑制率(花椒的體積濃度為15 mL/L,對NDMA的抑制率為74.07%)低10%,這是因為篩選的最優配比中各濃度要遠低于單一香辛料精油。在單因素試驗中,丁香精油為0.5 mL/L時,NDMA抑制率為62.05%,胡椒添加5 mL/L,對NDMA的抑制率達65.74%,而5種香辛料精油復配后,丁香精油僅需0.218 mL/L,胡椒精油僅需2.078 mL/L,NDMA抑制率即可達到64.412%±0.25%。所以,在腌肉制品加工中考慮到香辛料精油添加量對風味的影響,本研究的復配香辛料精油在起到抑制肉制品中N-亞硝胺形成的同時,還能賦予肉制品特有的風味,這一研究結果將對安全、味美的肉制品開發具有重要的指導作用。

4 結論

單因素實驗結果表明,在體外模擬亞硝化體系中,9種香辛料精油對NDMA的生成皆有抑制作用,但抑制作用的濃度和抑制率各有不同。丁香精油對NDMA 的抑制作用最強,其次是胡椒、花椒和八角精油,小茴香、桂皮和孜然需要較高濃度才表現出一定的抑制率,姜汁和蒜汁精油對NDMA的抑制率最弱。

五元二次回歸正交組合設計得到5種香辛料精油的最優體積濃度配比為:當胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香的體積濃度分別為2.078、3.118、3.692、2.833、0.218 mL/L時,由回歸方程得出對NDMA的抑制率理論值為63.327%,驗證試驗得到抑制率為64.412%±0.25%,說明得到的模型與實際擬合度較好。