Doehlert設計法結合渴求函數優化黨參中多成分的提取工藝

(張掖市質量檢驗檢測研究院,甘肅張掖 734000)

黨參為桔梗科植物黨參Codonopsispilosula(Franch). Nannf.、素花黨參CodonopsispilosulaNannf. var.modesta(Nannf.)L.T.Shen或川黨參CodonopsistangshenOliv.的干燥根,主要含有糖類、苷類、甾體類、氨基酸類、揮發油、三萜類、倍半萜內酯類等成分[1-4],具有補中益氣、健脾益肺、養血生津的功效[5]。2018年中華人民共和國國家衛生健康委員會發布的征求意見稿中黨參被收錄[6],進一步擴大了黨參作為一種天然保健植物的應用范圍。為更好的拓寬發展黨參價值,建立一種對其多成分同時具有較好提取效果的方法尤為必要。

目前,國內在提取工藝優化時常采用響應面法進行試驗設計[7-9]。其大部分選擇采用Central Composite Design(CCD)設計或Box-Benhnken Design(BBD)設計[10-12],這兩種模型試驗數多,且對不同影響因素不能采用不同的試驗數,對試驗設計要求較高。Doehlert設計是近年流行的一種新的設計方式,與其他設計方法,如CCD設計和BBD設計方法相比,具有試驗次數相對較少、效率高的特點。4因素試驗Doehlert設計僅需21組試驗,CCD設計和BBD設計則需要至少25組試驗[13]。同時Doehlert設計實驗點采用即相鄰的正六邊型的空間排列[14],各因素的水平數設置不同,可以根據這種性質自由選擇所考察因子設計的水平數,將有顯著影響的因子水平數設置較多數目,從而使設計更能反映試驗本身實際情況。同時結合渴求函數可以多重響應結果進行整體分析,找到最佳工藝條件[15],具有更加實用的意義。

關于黨參可溶性糖、紫丁香苷、黨參炔苷、浸出物的單獨提取工藝優化已有報道[16-20],上述成分同時提取的工藝條件建立及優化未見報道。本文嘗試采用Doehlert設計法結合渴求函數,以料液比、提取時間、乙醇濃度、超聲功率為考察因素,以黨參中可溶性糖、紫丁香苷、黨參炔苷、浸出物的含量為考察指標,通過整體渴求函數確定以上4種成分同時提取的最佳工藝條件,為黨參進一步開發利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桔梗科植物黨參飲片Codonopsispilosula(Franch). Nannf. 張掖德生堂藥店;黨參炔苷標準物質(批號:18127904,純度98%)、紫丁香苷標準物質(批號:17112804,純度98%) 成都普菲德生物技術有限公司;果糖、D-葡萄糖、蔗糖 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;乙醇(分析純)、甲醇(分析純，色譜純) 成都市科隆化學品有限公司;純凈水 華潤怡寶飲料中國有限公司。

LC-20AD型高效液相色譜儀(包括SPD-M20A二極管陣列檢測器,ELSD-LT II蒸發光散射檢測器)、InertSustain C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 日本島津公司;KH-250DB數控超聲波提取器 昆山禾創超聲儀器有限公司;CP225D十萬分之一電子天平、BS224S萬分之一電子天平 賽多利斯上海貿易有限公司;ML503/02千分之一電子天平 梅特勒-托利多國際上海貿易有限公司;HH恒溫水浴鍋 江蘇金壇市中大儀器廠;Venusil HILIC親水作用色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黨參炔苷與紫丁香苷的含量測定

1.2.1.1 黨參炔苷與紫丁香苷標準曲線的繪制 精密稱取紫丁香苷標準物質10.64 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成425.6 μg/mL的紫丁香苷儲備溶液;精密稱取黨參炔苷標準物質10.20 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成204.0 μg/mL的黨參炔苷儲備溶液。分別精密吸取紫丁香苷儲備溶液0.10、0.50、1.00、2.00、3.00 mL,黨參炔苷儲備溶液1.00、2.00、4.00、5.00、7.00 mL于10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,制成每1 mL分別含紫丁香苷4.3、21.3、42.6、85.1、127.7 μg,含黨參炔苷20.4、40.8、81.6、102.0、142.8 μg的混合標準曲線工作液。采用C18色譜柱,流動相A為甲醇,B為0.08%磷酸溶液,洗脫方式:梯度洗脫,0～10 min,6%甲醇,10～30 min,6%甲醇～14%甲醇,30～40 min,14%～24%甲醇,40～55 min,24%甲醇,55～61 min,6%甲醇,柱溫:35 ℃,采用二極管陣列檢測器,檢測波長:267 nm,流速:1.0 mL/min,進樣量10 μL。以峰面積為縱坐標(A),對照品濃度為橫坐標(C)繪制標準曲線。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 取黨參藥材粉末約1 g,精密稱定,置100 mL錐形瓶中,按最優提取工藝提取后,放冷,過濾,濾液水浴蒸干,殘渣加甲醇溶解,移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,既得測試樣品,按“1.2.1.1”色譜條件測定。

1.2.2 可溶性糖的測定

1.2.2.1 可溶性糖標準曲線的繪制 精密稱取果糖268.2 mg,置25 mL量瓶中,加10%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成10.73 mg/mL的果糖儲備溶液;精密稱取葡萄糖253.3 mg,置25 mL量瓶中,加10%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成10.13 mg/mL的葡萄糖儲備溶液;精密稱取蔗糖264.4 mg,置25 mL量瓶中,加10%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成10.58 mg/mL的蔗糖儲備溶液。分別精密吸果糖儲備溶液1.00、2.00、3.00、3.50、4.00 mL,葡萄糖儲備溶液1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL,蔗糖儲備溶液1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于10 mL量瓶中,加10%甲醇至刻度,搖勻,制成每1 mL分別含果糖1.1、2.2、3.2、3.8、4.3 mg,葡萄糖1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg,蔗糖1.1、1.6、2.1、2.6、3.2 mg的混合標準曲線工作液。采用HILIC親水作用色譜柱,流動相參考文獻[21]后經預試驗驗證,確定為A為乙腈,B為水,洗脫方式:等度洗脫,15%乙腈-水為流動相,柱溫:35 ℃,采用蒸發光檢測器,漂移管溫度40 ℃,流速:1.0 mL/min,進樣量10 μL,可溶性糖以果糖、葡萄糖、蔗糖三種糖總量計。因D-葡萄糖在常溫溶液中,會發生異構化現象,實際存在α-D-葡萄糖與β-D-葡萄糖兩種異構體[22-23],產生2個色譜峰,比例相對穩定在36∶64,故在分析中以α-D-葡萄糖與β-D-葡萄糖峰總面積作為葡萄糖的計算依據。以峰面積以10為底對數值為縱坐標(Alog),對照品濃度以10為底對數值為橫坐標(Clog)繪制標準曲線。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取黨參藥材粉末約1 g,精密稱定,置100 mL錐形瓶中,按最優提取工藝提取后,放冷,濾過,濾液置100 mL量瓶中,用少量提取溶劑分次洗滌容器,濾液濾入同一量瓶中,加溶劑至刻度,搖勻,既得測試樣品,按“1.2.2.1”所述色譜條件測定。

1.2.3 浸出物的測量 參照《中國藥典》2015年版四部2201浸出物測定法項下“熱浸法”[24],精密量取按最優提取工藝提取定容后溶液45 mL,置已干燥至恒重的蒸發皿中,在水浴上蒸干后,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定重量,進行計算。

1.2.4 提取工藝的優化 Doehlert設計是由考察的因子-水平數目及其設計矩陣編碼值來定義的[25-26],真實值和編碼值的關系見下式(1):

式(1)

Doehlert設計所需試驗次數N可用公式N=k2+k+C0表示,其中k為所考察因素的數目,C0表示中心點的數目,該數目用來評價模型的試驗誤差。結合其他文獻中對于單一成分的提取方法優化的結果[16-20],綜合考慮所涉及的影響因素,確定該試驗考察料液比(1∶15～1∶75)、提取時間(10～130 min)、乙醇濃度(28%～100%)、超聲功率(180～300 W)4個因素,按照式(1)方程計算編碼值。Doehlert設計矩陣選擇的各水平數及對應的編碼值見表1。

1.3 多重響應的數據處理

渴求函數法是將每個響應值Yi轉化為滿意度函數di,di∈[0,1]。響應越接近目標值,其滿意度越接近1,響應越接近規格限或超出規格限,滿意度就越接近0或等于0[27-28]。

取值越大越好的響應,研究人員可以選定一個下界值y-和一個上界值y+,當響應值Yi≤y-時,di=0,認為結果不可接受;響應值Yi≥y+,di=1,認為結果是最接近最佳狀況的;響應值Yi介于y+和y-之間時,di按公式(2)進行計算,其中r用來調整渴求函數的形狀。

式(2)

取值越小越好的響應,研究人員可以選定一個下界值y-和一個上界值y+,當響應值Yi≤y-時,di=1,認為結果是最接近最佳狀況的;響應值Yi≥y+,di=0,認為結果是不可接受;響應值Yi介于y+和y-之間時,di按公式(3)進行計算,其中r用來調整渴求函數的形狀。

式(3)

整體渴求函數D:假定某優化過程有m個響應,第i次響應已經選定了一個渴求函數di,其中i=1,…m,則整體渴求函數D可定義為di的加權幾何平均數。

式(4)

從公式(4)可得,若任意一個di=0,則D=0,整個過程不可被接受。能使D值最大化的因子水平即為最優化條件。

2 結果與分析

2.1 黨參炔苷與紫丁香苷色譜分離

按“1.2.1”項下方法對樣品進行處理,并按相應色譜條件進樣分析,結果如圖1,分離效果良好,說明該色譜條件滿足對樣品的測量要求。紫丁香苷標準曲線回歸方程:A=1976.85C-3196.06,R2=0.9963;黨參炔苷標準曲線回歸方程:A=11347.2C-18002.6,R2=0.9986。表明紫丁香苷濃度在4.3～127.7 μg/mL范圍內、黨參炔苷濃度在20.4～142.8 μg/mL范圍內響應值與其含量線性良好,可以滿足對樣品黨參炔苷與紫丁香苷的定量測量的需求。

圖1 對照品(A)與黨參樣品(B)色譜圖Fig.1 Chromatograms of control(A) and Codonopsis pilosula sample(B)注:1.紫丁香苷;2.黨參炔苷。

2.2 可溶性糖的色譜分離

按“1.2.2”項下方法對樣品進行處理,并按相應色譜條件進樣分析,結果如圖2,分離效果良好,說明該色譜條件滿足對樣品的測量要求。果糖標準曲線回歸方程:Alg=0.7657Clg-4.6882,R2=0.9973;葡萄糖標準曲線回歸方程:Alg=0.6981Clg-4.2127,R2=0.9976;蔗糖標準曲線回歸方程:Alg=0.7452Clg-4.5575,R2=0.9978,表明果糖濃度在1.1～4.3 mg/mL范圍內、葡萄糖濃度在1.0～3.0 mg/mL范圍內、蔗糖濃度在1.1～3.2 mg/mL范圍內響應值與其含量線性良好,可以滿足對樣品可溶性糖定量測量的需求。

表1 Doehlert設計矩陣及其編碼值Table 1 Doehlert matrix and its coded values for variables

注:括號里的數字為真實值。

圖2 對照品(A)與黨參樣品(B)色譜圖Fig.2 Chromatograms of control(A) and Codonopsis pilosula sample(B)注:1.果糖;2.α-D-葡萄糖;3.β-D-葡萄糖;4.蔗糖。

2.3 響應曲面的優化

2.3.1 多重線性回歸 響應曲面是通過建立響應值(因變量)與被考察因素(自變量)的函數關系,找到在響應值最大時,自變量的取值范圍即最佳試驗條件的方法[29-30]。本次試驗為4因素試驗,待擬合方程為:

式(5)

式中,Yi為響應值;X1～X4為考察因素;β0～β14為相關系數,分別表達了被考察因素的線性效應,二次效應和交互效應。

按“1.2.4”項下表1 Doehlert設計矩陣進行試驗,將分析得到的果糖,葡萄糖,蔗糖含量進行加和作為可溶性糖(Y1),與紫丁香苷(Y2)、黨參炔苷(Y3)、浸出物(Y4)的含量作為分析結果,通過SAS 8.0進行多元線性回歸擬合,通過方差分析判斷模型優劣,并進行顯著性檢驗,其中pY1、pY2、pY3、pY4為各響應值預測值。結果如表2。

多元線性回歸方程:

表2 響應值實測值與其預測值Table 2 Obtained and predicted values of responses

表3 各因素渴求值及整體渴求值Table 3 Desirability value of each factor and overall desirability value

圖3 交互作用響應面Fig.3 Response surface plots of interactions注:a～f分別表示X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4因素交互作用響應面圖及等高線圖。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)

多元線性回歸方程:

式(6)

2.3.2 響應曲面及其等高線 根據模型的回歸方程(6),選取交互關系顯著的因素,分別對其中2個變量取中值,代入回歸方程(6),應用Origin 6.0軟件繪制D與其他2個自變量的響應曲面及其等高線圖,結果如圖3。

通過上圖可以直觀觀察到兩個變量之間的交互作用,從響應曲面及其等高線圖的形狀上可以看出兩個變量間的交互作用的強弱,最佳優化劑量條件為曲面頂點附近的區域。可以看出,料液比、提取時間與超聲功率間存在明顯的相關性,原因可能是因為超聲提取中提取溶劑體積對超聲的傳導有影響,合適的料液比及超聲時間,有助于對目標成分的提取;乙醇濃度對于提取率有較為顯著的影響,與料液比存在明顯的交互關系,與其他因素則交互作用不明顯,原因可能是因為乙醇量的增加對于目標成分的溶解性增強,但過高的乙醇濃度會造成樣品中多糖的析出,影響整個提取過程。應用LINGO 9.0對整體渴求值D回歸方程進行計算,得到相應的自變量最佳取值,得到預測最佳提取結果:料液比1∶60,提取時間70 min,乙醇濃度64%,超聲功率240 W。該工藝下提取,預測可溶性糖含量469.51 mg/g,紫丁香苷含量92.32 μg/g,黨參炔苷含量332.77 μg/g,浸出物含量69.10%,預測整體渴求值pD為1。結合實際操作的便捷性,確定最佳提取條件:料液比1∶60,提取時間80 min,乙醇濃度70%,超聲功率250 W。

表5 優化工藝驗證(n=3)Table 5 Validation of optimized process(n=3)

2.4 優化工藝驗證

根據“2.3.2”項下最優提取條件,對黨參進行提取,得到各成分含量實測值,并求出實測整體渴求值D,并與預測值pD進行比較,由偏差的絕對值大小來判斷擬合方程是否能夠較好的描述因素與各成分含量的關系,結果如表5。4種目標成分提取率預測值和實測值較為接近,各成分實測渴求值d均在0.85以上,實測整體渴求函數D=0.91,與預測整體渴求值pD偏差9.0%,實測值與預測值偏差較小。

3 結論

本研究應用Doehlert設計結合渴求函數響應曲面優化法,以多個變量為指標,同時對多個影響因素進行優化,考察了料液比、提取時間、乙醇濃度、超聲功率4個因素對黨參中可溶性糖、紫丁香苷、黨參炔苷、浸出物提取效果的影響。試驗結果通過渴求函數處理后,采用多元回歸對數據進行擬合,再根據回歸方程繪制出響應曲面及其等高線圖,并結合計算機輔助計算,得到最佳工藝:料液比1∶60,提取時間70 min,乙醇濃度64%,超聲功率240 W,預測整體渴求值pD為1。結合實際操作的便捷性,實際操作采用:料液比1∶60,提取時間80 min,乙醇濃度70%,超聲功率250 W,該工藝下提取,實測可溶性糖含量434.14 mg/g,紫丁香苷含量86.37 μg/g,黨參炔苷含量287.94 μg/g,浸出物含量65.11%,實測整體渴求值D為0.91,實測值與預測值偏差較小。說明模型預測性良好,通過整體渴求函數確定以上4種成分同時提取的最佳工藝條件可行,可以為進一步開發黨參價值,拓寬黨參應用范圍和相關產業發展的提供一定的基礎。