大腸桿菌發酵產L-色氨酸培養基及補料優化

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(1.華東理工大學，生物反應器工程國家重點實驗室,國家生化工程技術研究中心,上海 200237; 2.浙江工業大學生物工程學院,浙江杭州 310014)

色氨酸是一種重要的芳香族氨基酸,具有獨特的吲哚側鏈[1],含有三種異構體,分別是L-型、D-型、DL-型,較常見且研究最多的是L-色氨酸。L-色氨酸對人類和動物而言屬于八大必需氨基酸中的第二必需氨基酸,在神經系統活動中起著重要的調節作用,廣泛應用于醫藥、食品和動物飼料添加劑的制作加工業[2],主要用于食品添加劑。此外,因其與金屬離子可以發生鰲合作用,具有抗氧化活性,可作為食品防腐劑和保鮮劑[3]。所以對于提升色氨酸產能水平的探索意義重大。

L-色氨酸可通過生物轉化、酶法和微生物發酵等途徑得到[4],利用大腸桿菌或谷氨酸棒狀桿菌發酵生產是目前使用最多的、綜合效益較高的方法[5]。日本協和發酵利用基因工程重組菌生產放大后L-色氨酸最高產量達到66 g/L,為目前行業報道的最高發酵水平,國內企業的L-色氨酸發酵產酸水平為25 g/L左右[6]。據近十年的數據統計,全球色氨酸的年需求量達到5萬噸,產量只有1萬噸左右,色氨酸的產量基本是供不應求的狀態[7]。色氨酸發酵生產的理論得率為0.227 g/g Glu[8],這一最大產量表明,理論上葡萄糖中不超過36.7%的碳可以轉化為L-色氨酸,其余的碳則被生物量增長和細胞呼吸等其他活動所消耗,因此,利用發酵工藝生產L-色氨酸，底物利用效率較低,這直接降低了潛在的工藝盈利能力[9]。除了菌株的選擇,培養基的成分對發酵法生產而言至關重要,培養基的成分及配比合適與否,對微生物的生長,發酵產品的生物合成、提取,甚至最后對成品的產量、質量都會產生相當大的影響。

本文對重組大腸桿菌發酵產L-色氨酸初始發酵培養基開展了基礎研究,在單因素優化篩選的基礎上,采用一系列統計學實驗設計方法找到影響發酵的關鍵培養基組分,得到了該菌株優化后的初始發酵培養基組合,提升了單位菌體L-色氨酸的比合成速率。為進一步優化色氨酸的合成效率、轉化率提供了數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌 浙江工業大學微生物菌種保藏室提供;葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、一水檸檬酸、七水硫酸鎂、酵母粉、氯化鈉、蛋白胨、瓊脂粉、乙酸銨、玉米漿、氫氧化鈉等 均為分析純,凌峰化學試劑有限公司;L-色氨酸 優級純,國藥集團化學試劑有限公司。

UV-2012PC型紫外可見分光光度計 美國Unico公司;TDL-80-2B離心機 上海安亭科學儀器廠;BSA224S-CW電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;DHP-9012電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;ZHWY-3212搖床 上海志誠儀器儀表有限公司;5 L發酵罐 上海國強生化工程裝備有限公司;SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所;DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海華連醫療器械有限公司;DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;YXQ-LS-SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;AGILENT 1100 series高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配方 種子平板活化培養基:1%蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%氯化鈉,2%瓊脂粉,pH7.0。

種子搖瓶培養基:3%葡萄糖,0.5%硫酸銨,2.4%磷酸氫二鉀,0.96%磷酸二氫鉀,1.52%酵母提取物,0.1%七水硫酸鎂,pH7.0。

初始發酵培養基:0.5%葡萄糖,0.22%硫酸銨,1.05%磷酸二氫鉀,0.28%一水檸檬酸,0.28%七水硫酸鎂,0.2%酵母提取物,pH6.5。

微量元素:1%七水合硫酸亞鐵,0.28%無水亞硫酸鈉,0.063%一水合硫酸錳,0.074%七水合硫酸鋅,0.008%五水硫酸銅,0.04%六水氯化鈷,用于發酵培養。

1.2.2 菌種培養方法

1.2.2.1 菌種活化 在無菌條件下,將甘油保種管內菌接至四環素(40 mg/L)抗性的LB固體培養基,37 ℃,培養16 h。

1.2.2.2 種子培養 用接種環刮取一環新鮮的菌落接至500 mL圓底三角瓶中,裝液量100 mL,四環素工作濃度為40 mg/L,8層紗布封口,置巡回式搖床上,220 r/min,35 ℃振蕩培養12 h。

1.2.2.3 搖瓶發酵 500 mL圓底三角瓶中裝液量50 mL,發酵搖瓶在滅菌前需額外加入碳酸鈣0.5 g/L用于短暫維持pH的穩定。接種量8%(V/V),8層紗布封口,置巡回式搖床上,220 r/min,35 ℃振蕩培養36 h。

1.2.2.4 5 L罐發酵 標定pH電極,用飽和亞硫酸鈉溶液標定溶氧0%。5 L發酵罐裝液量為 2.5 L,接種前溫度降至35 ℃,攪拌500 r/min,通氣量為3 L/min,定溶氧100%。接種量為8%(V/V),整個過程中流加25%氨水控制pH(6.5),流加泡敵消泡,調整轉速控制溶氧20%以上。當初始發酵培養基中的葡萄糖耗盡,開始流加質量濃度為65%的葡萄糖,起始流加速度1 g/L,溶氧持續回升,則增加補糖量,控制殘糖濃度0.01 g/L左右。

1.2.3 培養基成分單因素實驗

1.2.3.1 碳源 在前述初始發酵培養基基礎上,只改變碳源種類,考察四種不同的常見碳源(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖)對重組大腸桿菌代謝的影響。以加入等碳元素含量(葡萄糖0.5%)的原則進行搖瓶試驗,分析不同碳源對菌體生物量、殘糖含量、pH及L-色氨酸產量的影響。

1.2.3.2 無機氮源 在前述初始發酵培養基基礎上,只改變無機氮源種類,考察四種不同無機氮源(硫酸銨、硝酸銨、氯化銨和乙酸銨)對重組大腸桿菌代謝的影響。以加入等氮元素含量(硫酸銨0.22%)的原則進行搖瓶試驗,分析不同的無機氮源對單位菌體L-色氨酸產量、菌體生物量及L-色氨酸合成產量的影響。

1.2.3.3 有機氮源 在前述初始發酵培養基基礎上,只改變有機氮源種類,考察八種不同有機氮源(玉米漿、混合蛋白、酵母粉0810、牛肉膏、酵母粉0835、蛋白胨、酵母粉0815、酵母粉0805)對重組大腸桿菌代謝的影響。以加入等干物質含量0.2%為原則配制,分析其對單位菌體L-色氨酸產量、菌體生物量及L-色氨酸發酵產量的影響。

1.2.4 Plackett-Burman(PB)實驗設計 通過采用PB實驗設計,以單位菌體L-色氨酸產量和L-色氨酸產量為響應指標,篩選L-色氨酸合成過程中培養基中關鍵影響成分,選擇培養基成分中的八種重要組分進行系統篩選評估。組分包括:硫酸銨、乙酸銨、玉米漿、酵母粉、一水檸檬酸、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、微量元素,每個因素分高低兩個水平,因素水平設計見表1。

1.2.5 響應面試驗設計 采用Central-Composite Design(CCD)試驗設計,以L-色氨酸產量為響應指標,對PB實驗篩選出來的三個相對重要影響因素進行響應面試驗分析,CCD試驗設計因素水平參見表2。

表2 Central-Composite Design試驗因素與水平Table 2 Factors and levels based on central-composite design

表1 Plackett-Burman設計的因子和水平Table 1 Factors and levels designed in Plackett-Burman

1.2.6 種齡對發酵的影響 考察不同種齡對應的種子對優化前后培養基發酵的影響,選擇種齡10、12、14 h時接入發酵搖瓶進行發酵培養,找到最優的移種狀態。

1.2.7 乙酸銨和玉米漿間歇流加培養工藝設計 實驗分成四組:原始培養基組、優化培養基組、流加乙酸銨組、流加乙酸銨和玉米漿組。其中流加乙酸銨組:將培養基中的成分“乙酸銨”單獨配制,9.75 g乙酸銨定容至200 mL,采用補料間歇流加的方式于36 h補入發酵罐,乙酸銨液補率8 g/L·h;流加乙酸銨和玉米漿組:將培養基中的成分“玉米漿”和“乙酸銨”分別單獨配制,7.5 g玉米漿液定容至50 mL,9.75 g乙酸銨定容至150 mL,分別于24、36 h間歇流加補入發酵液中,玉米漿液補率2 g/L·h,乙酸銨液補率6 g/L·h。

1.2.8 指標測定方法

1.2.8.1 菌體生物量測定 發酵液稀釋至適當倍數于分光光度計上測定OD600。

1.2.8.2 殘糖濃度測定 對于非還原性的雙糖采用酸水解法使其降解成還原性單糖后,采用DNS法[10]和SBA-40E生物傳感分析儀測定。得到標準曲線y=1.3613x+0.0461,R2=0.9984。

1.2.8.3 L-色氨酸含量測定 采用對二甲胺基苯甲醛比色測定法[11]。其中標準曲線為y=207.97x+5.8789,R2=0.9994。

1.2.8.4 乙酸測定 采用HPLC法測定[12]。

1.2.8.5 單位菌體L-色氨酸產量計算 單位菌體L-色氨酸產量=單位體積培養液中L-色氨酸含量/菌體濃度OD600

1.3 數據處理

所有實驗均重復三次。利用Origin 2016軟件進行數據作圖分析。使用軟件Design Expert 7.0進行因素顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同碳源對重組菌株發酵的影響 不同碳源對重組大腸桿菌發酵色氨酸的結果見圖1。發酵結束時，葡萄糖為碳源的情況下菌體濃度最高,OD600是其他組的1.5～2倍。L-色氨酸的合成量也最大,是其他組的2～4倍。根據圖1的殘糖及pH對比,蔗糖和乳糖組殘糖和pH較高,說明該菌株對蔗糖和乳糖的利用度較差,這可能與該菌種分解蔗糖和乳糖的酶系活力低有關[13]。所以選擇葡萄糖作為后續實驗使用的碳源。

圖1 不同碳源對L-色氨酸發酵的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on L-tryptophan fermentation

2.1.2 不同無機氮源對重組菌株發酵的影響 不同無機氮源對重組大腸桿菌發酵色氨酸的結果見圖2。如圖2a,氯化銨為氮源的條件下,菌體OD600值略高于其它氮源,L-色氨酸的產量也同比高于硫酸銨和硝酸銨為氮源的發酵組,硫酸銨組單位菌體產量略高于氯化銨和硝酸銨組。乙酸銨為氮源時,菌體的濃度比硫酸銨和硝酸銨為氮源的發酵組低,但L-色氨酸的生成量達到了1118 mg/L,與其它三種無機氮源相比,提升了21%以上。尤其是以乙酸銨為氮源時單位菌體的L-色氨酸合成量最高達到了175 mg/OD,與其它三種無機氮源相比整體提升了30%以上(圖2b)。可見乙酸銨雖然對菌的生長有一定抑制作用,但是對單位菌體的產量提升有很大的效用。可能是乙酸銨中除含有與硫酸銨等量的氮元素外,其還含有兩個碳原子,在葡萄糖耗盡缺乏碳源時,乙醛酸通路被激活,菌體會利用乙酸進行合成代謝,替代TCA循環的部分代謝途徑,使菌體更高效地利用碳源,而導致乙酸銨組效果比硫酸銨組效果好,但是在其他文獻中乙酸對菌體生長和色氨酸合成均不利[14-15]。鑒于乙酸銨這種物質成分的特殊性,選擇硫酸銨和乙酸銨進行后續的顯著因素篩選試驗。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

圖2 不同無機氮源對L-色氨酸發酵的影響Fig.2 Effects of different inorganic nitrogen sources on L-tryptophan fermentation

2.1.3 不同有機氮源對重組菌株發酵的影響 不同有機氮源對重組菌株發酵的影響見圖3。如圖3a,酵母粉0810最有利于菌的生長,玉米漿組菌濃度最低,低于最高組的30%左右,且有文獻報道稱玉米漿一般含10%左右的乳酸,且玉米漿的利用會促進大腸桿菌對乙酸的積累[16],可能都會對菌的生長有一定抑制作用。但是由L-色氨酸的合成來看,圖3a中玉米漿氮源組的L-色氨酸產量最高達到了1223 mg/L,其次是混合蛋白、酵母粉0810。根據單位菌體產量的統計結果可知,玉米漿組的單位菌體產量最高達到了292 mg/OD,遠高于混合蛋白組的260 mg/OD,比其他氮源組(131～166 mg/OD)相比提升了76%以上。后續選擇玉米漿和酵母粉0810進行顯著性因素分析試驗。

圖3 不同有機氮源對L-色氨酸發酵的影響Fig.3 Effects of different organic nitrogen sources on L-tryptophan fermentation

2.2 PB實驗結果與分析

表4 單位菌體L-色氨酸產量的Plackett-Burman設計方差分析Table 4 Results of Plackett-Burman design ANOVA analysis of the production of L-tryptophan in per unit cell

注:*表示顯著(P<0.05);**表示極顯著(P<0.01);表5、表7同。

表5 L-色氨酸產量的Plackett-Burman設計方差分析Table 5 Results of Plackett-Burman design ANOVA analysis of the production of L-tryptophan

以單位菌體L-色氨酸產量和L-色氨酸產量為評價指標,12組矩陣因素水平組合結果見表3。以單位菌體L-色氨酸產量(表4)和L-色氨酸產量(表5)為響應值的方差分析結果顯示,乙酸銨和酵母粉對單位菌體L-色氨酸生物合成影響極顯著(P<0.01),而對于L-色氨酸產量的影響,表5 的模型不顯著,但在一定程度上可反映出,相對于PB中的其他因素而言,除乙酸銨外,酵母粉0810是影響最大的一個因子,其次是玉米漿,且由以上單因素實驗中不同有機氮源對L-色氨酸合成影響可知,玉米漿對L-色氨酸產量的提升也有一定正向調節作用,試驗選擇乙酸銨、酵母粉0810、玉米漿進行后續CCD考察。本實驗中最高發酵單位達到了1369 mg/L,最高單位菌體L-色氨酸產量達到了276 mg/OD,可見這些組分的交互搭配對于提升L-色氨酸產量和產率是至關重要的。

2.3 響應面實驗結果與分析

表6 Central-Composite Design試驗設計及結果Table 6 Design and results of central-composite design experiments

表7 Central-Composite Design設計方差分析Table 7 Results of Central-Composite Design ANOVA analysis

表8 優化前后培養基搖瓶發酵參數Table 8 Fermentation parameters of original and optimized medium in shake flasks

表9 不同培養時間種子液培養結果參數對比Table 9 Comparison of parameters for different culture time of seeds

2.4 搖瓶發酵驗證

各成分最優配比為酵母粉0810 0.5 g/L、乙酸銨3.9 g/L、玉米漿3 g/L時,對應的響應值最大,L-色氨酸預測值可達1432 mg/L。

為了驗證模型的準確性,在預測最佳培養基配方條件下進行大腸桿菌發酵產L-色氨酸重復實驗3次,優化后的培養基搖瓶發酵驗證結果見表8,優化培養基發酵L-色氨酸產量達到了1451.30 mg/L,與模型預測的值非常接近。與優化前的培養基發酵色氨酸產量(746.23 mg/L)相比提高了94.5%。但是優化后的培養基發酵菌體濃度OD600較低,說明此培養基中的某些成分對菌的生長有一定抑制作用,但是單位菌體L-色氨酸產量提高了140%,說明優化培養基是有利于產物合成的。綜合PB和CCD實驗結果，優化后培養基組合：0.12%硫酸銨、0.7%磷酸二氫鉀、0.15%一水檸檬酸、0.28%七水硫酸鎂、0.05%酵母粉0810、0.39%乙酸銨、0.3%玉米漿。

2.5 不同種齡對發酵的影響

不同種齡種子的培養結果見表9,隨著培養時間的延長,菌體濃度OD600逐漸上升。10 h后種子進入快速生長期,培養14 h的種子液酸味較重,乙酸含量檢測結果顯示種子液已經開始積累代謝副產物乙酸,這可能是菌體濃度高的情況下氧限制引起的[18]。

不同種齡的種子接種發酵搖瓶培養結果見圖4。如圖4b原始培養基中,隨著種齡增長,單位菌體L-色氨酸產量略有提高,菌體濃度略有上升(圖4a),所以L-色氨酸產量也逐步上升(圖4c)。優化培養基中12 h種齡的種子對應的發酵液菌體濃度最高(圖4a),L-色氨酸的產量也高于10和14 h種齡的種子對應的發酵產量,達到了1293 mg/L(圖4c),對應的單位菌體L-色氨酸產量達到了238 mg/OD(圖4b)。14 h種齡的種子對應的發酵無論是菌體濃度,還是L-色氨酸產量都明顯低于其他種齡對應的狀態。發酵搖瓶的菌體濃度比12 h種齡的對應的發酵少了35%以上,OD600只有3.3左右,這可能與種子培養時間過長菌體活力下降有關,同時接入發酵瓶后乙酸等副產物可能會抑制了菌的生長[19]。

相對于原始培養基,優化后培養基L-色氨酸產量有較大提升,但是菌濃略有下降。不同種齡對優化培養基發酵結果影響很大,種齡12 h發酵L-色氨酸產量最高,菌體生長代謝較旺盛,綜合考量選擇12 h種齡接入發酵更有利于菌體合成。

圖4 種齡對發酵的影響Fig.4 Effects of seed age on fermentation

2.6 5 L發酵罐補料分批培養

將優化培養基與原始培養基在5 L罐上進行補料分批培養的放大對比驗證,結果見圖5。各發酵參數對比見表10。

由圖5a可知,使用優化后培養基在5 L罐上發酵菌體的延滯期較長,其整體生長進度延滯了24 h左右。優化后培養基菌體的延滯期較長主要與培養基成分乙酸銨有關,乙酸對菌體的生長有抑制作用[14],由于前期高濃度乙酸的存在使得延滯期較長。菌體在緩慢利用完基礎培養基中葡萄糖后,會啟動乙醛酸支路[20],開始消耗發酵液中的乙酸,且大腸桿菌在外源乙酸的存在下會傾向于避免自身乙酸的生成,對發酵后期的產物合成速率較高有一定幫助[21-22]。

圖5 初始培養基與優化培養基5 L罐發酵參數對比Fig.5 Comparison of fermentation parameters between initial medium and optimized medium in 5 L tank

將成分“乙酸銨”改成中后期流加控制,待菌體濃度增長到一定程度,采用間歇流加方式將乙酸銨補入發酵液,由圖示5c可知,流加乙酸銨組發酵液中乙酸含量在36 h后逐漸上升,菌體的生長速率開始減緩(圖5a),與優化培養基組相比，采用流加的方式使菌的生長延滯期縮短,L-色氨酸產量隨著菌體濃度的快速升高有較大提高(圖5b),發酵結束時，流加乙酸銨組L-色氨酸產量比原始培養基組提高了17%左右,且在發酵后期L-色氨酸合成速率和單位菌體L-色氨酸產量明顯高于原始培養基組,單位菌體的L-色氨酸產量達到了282 mg/OD。說明乙酸銨的合理補加是有利于L-色氨酸的合成的,且采用乙酸銨流加的方式大大改善了高濃度乙酸銨造成的菌體延滯期長的問題。

菌的延滯期相對于對照(原始培養基組)較長,除了與原始培養基中乙酸含量高有關,與有機氮源玉米漿的量也有很大的關系,單因素實驗結果顯示玉米漿添加組菌體生長量最低,說明玉米漿對前期菌體的生長的確是有抑制作用的,因此實施乙酸銨和玉米漿單獨流加工藝,發酵培養24 h后開始流加玉米漿,發酵36 h時開始流加乙酸銨。表10結果表明,這種方法能夠大大縮短菌體生長的延滯期。

表10 初始培養基與優化培養基5 L罐發酵參數Table 10 Fermentation parameters of initial medium and optimized medium in 5 L tank

在發酵中后期,流加乙酸銨和玉米漿組依然能夠維持菌體濃度較高的比生長速率,由色氨酸產量曲線變化斜率可知，L-色氨酸合成速率也明顯提升,玉米漿和乙酸銨相結合的氮源補加方式使得發酵L-色氨酸產量提高了35%,糖酸轉化率最高達到了14.25%,比原始培養基組(11.26%)提高了27%。說明采用這種分批補料的方式可以進一步優化發酵過程,提升了發酵效能。

3 結論

本實驗利用一系列統計學實驗設計方法優化了大腸桿菌產L-色氨酸原初始發酵培養基組合成分,以及對移種時間進行選擇,從而提高了L-色氨酸的合成量,并最終在5 L發酵罐上進行驗證,針對在罐上放大出現的延滯期長的問題,本文提出了一種新型的補料優化模式,實施了乙酸銨和玉米漿流加控制工藝。這種方法能夠大大縮短菌體生長的延滯期,在發酵中后期,依然能夠維持較高的比生長速率,色氨酸合成速率也明顯提升,玉米漿和乙酸銨相結合的氮源補加方式能促使L-色氨酸產量提高35%,糖酸轉化率最高達到14.25%,比原始培養基組提高了27%,優化效果顯著,為菌體合成L-色氨酸培養基開發、補料工藝研究提供一定參考。本文使用低成本的有機氮源玉米漿部分代替酵母粉,以及發現乙酸銨對大腸桿菌發酵產L-色氨酸產量提升的特殊作用,目前這只在利用微生物轉化法生產L-色氨酸中簡單提及,這對進一步提升L-色氨酸產量的探索具有一定研究意義,未來可以從基因分子層面、胞內代謝流變化角度進一步研究以解釋這種調控作用,后續應進一步探索補氮條件,對精準流加稀釋后的有機氮源如玉米漿等采取進一步優化,可能會有新的成效,為實現更精確的補氮控制模式奠定基礎。