靈芝菌生物發(fā)酵北五味子果汁降酸工藝優(yōu)化及其護(hù)肝作用

辛 宇,邱智東,伍法杰,張彥飛,曲 墨,羅浩銘,王偉楠

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130117)

北五味子(Schisandrachinesis(Turcz.)Baill)是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源中藥材,其主要成分為木脂素、揮發(fā)油、多糖、多酚、有機(jī)酸等成分[1-2]。因其具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理保健功能,被認(rèn)為是品質(zhì)優(yōu)良的食品和藥品原料[3-5]。然而,北五味子中的可滴定酸含量與檸檬接近,酸度過高導(dǎo)致北五味子糖酸比例不協(xié)調(diào)、口感風(fēng)味不佳,高濃度的有機(jī)酸和較低的pH對(duì)人體牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)也具有腐蝕作用,制約了北五味子果汁的深度開發(fā)[6-9]。因此在保持濃郁香氣和營(yíng)養(yǎng)成分的前提下,降低酸度是改善北五味子口感和生產(chǎn)北五味子保健產(chǎn)品的重要途徑。

目前降酸的方法主要有化學(xué)法、樹脂法和生物法[10-11]。化學(xué)降酸法是通過加入CaCO3等化學(xué)試劑,使其發(fā)生中和反應(yīng)來降低果汁中的部分有機(jī)酸,但這種方法在果汁儲(chǔ)藏過程中會(huì)產(chǎn)生鹽類沉淀,且外源性化學(xué)試劑的加入也會(huì)對(duì)降酸后的產(chǎn)品使用安全性造成影響;樹脂降酸法主要采用堿性離子交換樹脂對(duì)北五味子果汁中的酸性成分進(jìn)行吸附,以達(dá)到降酸目的,但會(huì)使北五味子果汁中的營(yíng)養(yǎng)成分大量流失,在降酸的同時(shí)也降低了北五味子果汁的附加值;生物降酸法主要是利用微生物代謝,在一定的條件下,分解北五味子果汁中的有機(jī)酸,形成酸度較低的其他活性物質(zhì),從而達(dá)到降低酸度的目的,該方法相較上述兩種方法而言,具有條件綠色、反應(yīng)溫和、食用安全性高等優(yōu)點(diǎn),可以作為北五味子果汁降酸的主要手段。

目前有關(guān)北五味子果汁生物降酸國(guó)內(nèi)還未見報(bào)道,因此本文通過菌種篩選確定靈芝菌作為果汁生物降酸實(shí)驗(yàn)研究的菌種,進(jìn)而利用生物法降低北五味子果汁中有機(jī)酸的含量,為高品質(zhì)、高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的北五味子高端保健飲品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北五味子新鮮果實(shí) 吉林省北佳中藥科技開發(fā)有限公司提供,長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥品種質(zhì)量鑒定實(shí)驗(yàn)室鑒定為北五味子(Schisandrachinesis(Turcz.)Baill);靈芝菌(Ganodermalucidum,CGMCC編號(hào)5.644) 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供;健康Wistar大鼠(雄性,150～200 g,許可證號(hào):SCXK(吉)2018-0007) 長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,自由進(jìn)食進(jìn)水適應(yīng)環(huán)境一周,備用;無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 純度>98%,中國(guó)藥品生物制品檢定所;色譜甲醇 色譜純,美國(guó)Thermo Fisher公司;硫酸鎂、碳酸鈣、硫酸錳、磷酸二氫鉀、葡萄糖、維生素B1分析純，西隴科學(xué)股份有限公司;蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸粉 生化試劑,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒 南京建成生物。

YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;pHBJ-260型便攜式pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;TG328A(S)分析天平 上海精科分析儀器廠;EL-204型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ-500B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠;TU-1080紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用有限責(zé)任公司;冷凍干燥機(jī) 美國(guó)labconco公司;Sorvall Evolution RC離心機(jī) 美國(guó)Sorvall公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 北五味子果汁的處理 將北五味子新鮮果實(shí)放入干凈的大燒杯中,除去果梗,用16層紗布擠出果汁,分離果肉和種子,測(cè)定果汁體積后進(jìn)行冷凍干燥,得到凍干粉末,密封避光低溫保存,備用。計(jì)算得到果汁凍干粉的得率約為5%。

果汁凍干粉得率(%)=(凍干粉重量/原果汁體積)×100

1.2.2 菌種的復(fù)蘇、復(fù)壯及種子液的制備 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基的制備:馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉15 g/L。種子液培養(yǎng)基的制備:蛋白胨10 g/L、酵母浸粉2 g/L、葡萄糖20 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、碳酸鈣0.1 g/L、硫酸錳0.1 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、維生素B110 mg/L、蒸餾水1 L、自然pH。

將靈芝菌斜面從低溫冷藏冰箱中取出,迅速移至30 ℃水浴中加熱30 min后,擦干試管表面,將斜面放置在28 ℃的微生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,取出接種到新的PDA斜面培養(yǎng)基中,在28 ℃的微生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d,待白色菌絲長(zhǎng)滿斜面之后,向斜面試管中加入1/5試管體積的生理鹽水,旋渦振蕩10 s,將孢子懸液轉(zhuǎn)移到無菌三角瓶中,利用血球計(jì)數(shù)板法將孢子懸液濃度調(diào)節(jié)至1×107spores/mL,備用。取一定體積的孢子懸液按照體積比1∶20加入液體培養(yǎng)基中,于28 ℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)5～6 d后,即得靈芝菌搖瓶種子液。

1.2.3 北五味子果汁生物發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 將北五味子果汁凍干粉溶于20倍體積的蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌20 min,無菌條件下放至室溫后轉(zhuǎn)移至28 ℃的恒溫?fù)u床中備用。固定接種量5%(V/V)、接種菌齡5 d、振蕩速度160 r/min,依次考察發(fā)酵時(shí)間0、2、4、6、8、10、12、14、16 d的果汁pH,繪制pH變化曲線作為最適發(fā)酵時(shí)間選擇的依據(jù);固定發(fā)酵時(shí)間12 d、接種菌齡為5 d、振蕩速度160 r/min,依次考察接種量2.5%、5.0%、7.5%、10.0%(V/V)對(duì)果汁pH變化的影響;固定接種量5%(V/V)、振蕩速度160 r/min、發(fā)酵時(shí)間12 d,依次考察接種菌齡2、3、4、5、6、7 d對(duì)果汁pH變化的影響;固定接種菌齡3 d、接種量5%(V/V)、發(fā)酵時(shí)間12 d,依次考察振蕩速度140、160、180、200 r/min對(duì)果汁pH變化的影響;固定接種菌齡3 d、接種量5%(V/V)、發(fā)酵時(shí)間12 d、振蕩速度180 r/min,依次考察生長(zhǎng)因子維生素B1濃度0、5、10、20、40、80 mg/L對(duì)果汁pH變化的影響。

1.2.3.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)1.2.3.1結(jié)果選擇4個(gè)主要因素進(jìn)行L9(34)四因素三水平的正交設(shè)計(jì),分析各因素對(duì)北五味子果汁pH的影響,確定最佳發(fā)酵工藝,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,正交因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels design for orthogonal experiments

1.2.4 北五味子果汁生物發(fā)酵過程及發(fā)酵產(chǎn)物處理 根據(jù)優(yōu)化后的工藝獲得北五味子生物發(fā)酵產(chǎn)物。將發(fā)酵產(chǎn)物在60 ℃下超聲振蕩60 min,取出,在10000 r/min下,離心15 min,取上清液,即得北五味子發(fā)酵果汁;將北五味子發(fā)酵果汁于-50 ℃,8 Pa凍干,稱重,密封避光低溫保存,備用。

1.2.5 pH和酸度測(cè)定 pH采用精密pH計(jì)直接測(cè)定;酸度采用酸堿滴定法測(cè)定[12]。

式中:CNaOH:滴定所用NaOH溶液的濃度,g/L;VNaOH:滴定所用NaOH溶液體積,mL;VSC:被滴定的北五味子果汁體積,mL。

1.2.6 多糖含量測(cè)定方法

1.2.6.1 標(biāo)曲的建立 精密稱量無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,置100 mL容量瓶中,用蒸餾水定容,配成濃度為0.1016 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13-14]。建立回歸方程為y=0.05656x-0.02524,R2=0.9995,標(biāo)準(zhǔn)品溶液在1.27～12.7 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

1.2.6.2 供試品溶液的制備及其多糖含量的計(jì)算 稱量50.6 mg北五味子鮮果果汁凍干粉末和50.7 mg北五味子發(fā)酵物凍干粉末,分別加入25 mL蒸餾水,充分溶解、過濾,續(xù)濾液定容至25 mL配成供試品溶液;精密吸取發(fā)酵前后的供試品溶液各0.4 mL,按照1.2.6.1中的方法處理后,以不含樣品的溶液為空白對(duì)照,測(cè)定其在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算鮮果汁和發(fā)酵物中多糖的含量,該實(shí)驗(yàn)平行三次,測(cè)定結(jié)果以平均值計(jì)。

1.2.7 多酚含量測(cè)定方法

1.2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱量沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,用蒸餾水定容,配成濃度為0.1024 mg/mL的對(duì)照品溶液,分別精密量取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15-18]。建立回歸方程為y=0.12095x+0.06581,R2=0.9996,說明沒食子酸對(duì)照品在0.8020～4.9150 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

1.2.7.2 供試品溶液的制備及其多酚含量的計(jì)算 稱量1.0008 g北五味子鮮果果汁凍干粉末和1.0005 g發(fā)酵后凍干粉末,加入蒸餾水25 mL,超聲(40 kHz、30 ℃)提取1.5 h,過濾,續(xù)濾液定容至25 mL即為供試品溶液。精密吸取發(fā)酵前后的供試品溶液各0.5 mL,按照1.2.7.1中的方法處理后,以不含樣品溶液為空白對(duì)照,測(cè)定其在760 nm波長(zhǎng)下的吸光度值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算鮮果和發(fā)酵物中多酚的含量,該實(shí)驗(yàn)平行三次,測(cè)定結(jié)果以平均值計(jì)。

1.2.8 黃酮含量測(cè)定方法

1.2.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱量蘆丁對(duì)照品,用60%甲醇稀釋至刻度,配成濃度為10.42 μg/mL的對(duì)照品溶液,分別精密量取0.1、0.4、1.0、2.0、3.0和4.5 mL對(duì)照品溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[19-22]。建立回歸方程為y=0.01203x+0.0592,R2=0.9997,說明蘆丁對(duì)照品在1.042～46.89 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

1.2.8.2 供試品溶液的制備及其黃酮含量的計(jì)算 分別稱量1.0008 g北五味子鮮果果汁凍干粉末和1.0005 g發(fā)酵后凍干粉末,加入60%甲醇25 mL,超聲(40 kHz、30 ℃)提取1.5 h,補(bǔ)足失重,過濾即為供試品溶液;精密吸取發(fā)酵前后供試品溶液各5 mL,按照1.2.8.1中的方法處理后,以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照,測(cè)定在510 nm波長(zhǎng)下的吸光度值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算鮮果和發(fā)酵物中黃酮的含量,該實(shí)驗(yàn)平行三次,測(cè)定結(jié)果以平均值計(jì)。

1.2.9 發(fā)酵前后北五味子果汁對(duì)酒精肝大鼠模型中AST和ALT活力的影響

1.2.9.1 分組及給藥 將50只大鼠按體重隨機(jī)分為5組,每組10只,即空白對(duì)照組(正常組)、模型對(duì)照組(酒精肝損傷模型組)、北五味子鮮果組、北五味子發(fā)酵組及陽性對(duì)照組(聯(lián)苯雙酯組)。

將空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等體積的生理鹽水,鮮果組和發(fā)酵組均按大鼠體重200 mg/kg進(jìn)行灌胃,連續(xù)給藥7 d,于給藥第6 d晚上禁食,末次給藥1 h后,除空白對(duì)照組外,其余各組均按12 mL/kg灌胃50%乙醇溶液,造成急性酒精肝損傷。

1.2.9.2 血清采樣檢測(cè) 末次給藥后8 h,處死大鼠,解剖取肝臟。將各組動(dòng)物腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg進(jìn)行麻醉,腹主動(dòng)脈采血6 mL,分離血清,注入干凈的采血試管內(nèi),4 ℃、2000 r/min,離心10 min,分離血清,按照天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒說明書比色法測(cè)定。

1.2.9.3 組織采樣檢測(cè) 取肝臟組織塊(0.2～1.0 g),用冰冷的生理鹽水清洗,濾紙拭干,稱重,剪碎,置于玻璃勻漿器中,加入冰生理鹽水制成10%的組織勻漿,3000 r/min,離心15 min,取上清液,稀釋為10%的組織勻漿,按照天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒說明書比色法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)平均誤差(Means±SD)表示。差異顯著性檢驗(yàn)采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。以P<0.01作為具有極顯著性差異,P<0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 果汁生物降酸工藝研究單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間的考察 經(jīng)過測(cè)定,高壓滅菌之后的北五味子果汁pH≈1.8,在這種強(qiáng)酸環(huán)境下,靈芝菌的生長(zhǎng)會(huì)受到一定程度的抑制。靈芝菌在北五味子果汁中的發(fā)酵狀況以及不同發(fā)酵時(shí)間靈芝菌的代謝活動(dòng)對(duì)北五味子果汁pH的影響如圖1所示。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)果汁pH的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the pH value of juice

通過靈芝菌的生物發(fā)酵,北五味子果汁的pH得到了顯著的改善,從0～6 d,果汁的pH迅速提高,可能是正處于靈芝菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌絲體生長(zhǎng)代謝旺盛而引起的。從第6 d開始,果汁pH變化趨于緩和,到達(dá)第12 d后pH基本保持不變,所以確定最佳發(fā)酵時(shí)間為12 d。

2.1.2 接種量的考察 初始接種量大,利于菌種適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境,加快生物量累計(jì)的效率,然而,菌種的生長(zhǎng)與特定物質(zhì)的代謝并不一定呈正相關(guān)性,且接種量過大,會(huì)消耗北五味子果汁中大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),降低北五味子發(fā)酵果汁的營(yíng)養(yǎng)附加值,因此,考察接種量是生物降酸工藝摸索的重要環(huán)節(jié)之一。

由圖2可知,當(dāng)初始接種量位于2.5%～5.0%之間時(shí),靈芝菌對(duì)北五味子果汁中的酸性物質(zhì)代謝速率隨著接種量的增加迅速提高,pH上升幅度較大,在接種量5%時(shí)達(dá)到峰值,之后pH維持一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),所以選擇接種量4%、5%、6%進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖2 接種量對(duì)果汁pH的影響Fig.2 Effect of inoculation volume on the pH value of juice

2.1.3 菌齡的考察 微生物在新培養(yǎng)環(huán)境中的生長(zhǎng)和代謝情況,與接種時(shí)的菌齡有很大的關(guān)聯(lián),菌齡太短或太長(zhǎng)均對(duì)發(fā)酵效果不利,一般來講,處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種能夠在新的培養(yǎng)基中快速繁殖,加快生物量的積累和代謝反應(yīng)的發(fā)生[23]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇一定菌齡范圍的靈芝菌,平行接種到北五味子滅菌果汁中,考察最適的發(fā)酵菌齡,結(jié)果如圖3所示。

圖3 接種菌齡對(duì)果汁pH的影響Fig.3 Effect of inoculation age on the pH value of juice

接種菌齡小于2 d的靈芝菌在北五味子果汁中生長(zhǎng)緩慢,發(fā)酵后果汁pH的提高幅度較低;當(dāng)菌齡處于3～5 d時(shí),發(fā)酵后的果汁pH均大于3;菌齡大于5 d后,果汁pH開始下降;考慮到實(shí)驗(yàn)周期的問題,故選擇菌齡3、4、5 d進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 振蕩速度的考察 在微生物培養(yǎng)過程中,振蕩不僅可以提高微生物與培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的接觸幾率，使同一生物發(fā)酵體系中的微生物生長(zhǎng)代謝進(jìn)程相對(duì)均勻,而且還決定著液體培養(yǎng)基中的溶氧和二氧化碳濃度,因此,振蕩速度是一項(xiàng)非常重要的考察參數(shù)[24]。

通過圖4可以看出,當(dāng)振蕩速度小于160 r/min時(shí),靈芝菌在北五味子果汁中的發(fā)酵效率較低,pH沒有明顯的變化,當(dāng)振蕩速度大于160 r/min后,發(fā)酵果汁中的pH有了一定程度的提高,并且在180 r/min達(dá)到最大值;振蕩速度在180～200 r/min時(shí),發(fā)酵果汁中的pH明顯下降,所以選擇振蕩速度170、180、190 r/min進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖4 振蕩速度對(duì)果汁pH的影響Fig.4 Effect of vibration speed on the pH value of juice

圖5 維生素B1對(duì)果汁pH的影響Fig.5 Effect of VB1 on the pH value of juice

2.2 果汁生物降酸工藝研究正交試驗(yàn)

由表2和表3可知,接種量(A)的變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響最為顯著,最終確定北五味子果汁生物發(fā)酵降酸工藝的最佳條件為A3B3C1D3,即:接種量為6%(V/V);維生素B1的加入量為10 mg/L;接種菌齡為3 d的靈芝菌;搖床振蕩速度為190 r/min。

表2 正交分析表Table 2 Orthogonal analysis

表3 L9(34)正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果表Table 3 Variation analysis of L9(34)orthogonal tests

2.3 發(fā)酵工藝驗(yàn)證

稱取北五味子鮮果汁凍干粉1 g,加入20 mL蒸餾水,0.2 mg維生素B1,121 ℃滅菌20 min,按6%(V/V)的接種量接種菌齡3 d的靈芝菌,在190 r/min、28 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 d,測(cè)定pH和滴定酸度變化,該實(shí)驗(yàn)平行三次,結(jié)果見圖6。三批試驗(yàn)菌體pH之間無明顯差異,發(fā)酵后的pH范圍穩(wěn)定在3.18～3.22之間,通過靈芝菌的生物發(fā)酵,北五味子果汁的滴定酸度下降了53.7%。

圖6 生物降酸工藝驗(yàn)證結(jié)果Fig.6 Verification results for deacidification process

2.4 果汁發(fā)酵產(chǎn)物主要活性成分的含量測(cè)定

通過對(duì)多糖、黃酮、多酚的含量進(jìn)行測(cè)定結(jié)果見表4,發(fā)現(xiàn)果汁經(jīng)過發(fā)酵之后多糖的含量提高了61.5%,而多酚和黃酮的含量分別降低了64.2%和50.6%。在靈芝菌液體發(fā)酵過程中,多糖是其最重要的代謝產(chǎn)物之一,因此,果汁中多糖含量的升高可能與靈芝多糖的合成與分泌有關(guān)[26];另一方面,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,靈芝菌在發(fā)酵過程中分泌的漆酶可以氧化并生物降解苯酚和黃酮等多酚類化合物,在本實(shí)驗(yàn)中,這可能是導(dǎo)致北五味子果汁中該類成分含量下降的主要原因[27]。

表4 果汁發(fā)酵前后主要成分含量變化表Table 4 Contents variation of major components in juice before and after fermentation

2.5 發(fā)酵前后北五味子果汁對(duì)大鼠酒精肝損傷的保護(hù)作用比較

2.5.1 血清及組織ALT測(cè)定結(jié)果 如表5所示，與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組大鼠血清及肝組織丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性極顯著增加(P<0.01);與模型對(duì)照組相比,北五味子鮮果組、北五味子發(fā)酵組及陽性對(duì)照組大鼠血清及肝組織丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01);與北五味子鮮果組相比,北五味子發(fā)酵組及陽性對(duì)照組大鼠血清及肝組織丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性顯著降低(P<0.05)。

表5 酒精性肝損傷大鼠血清及肝組織 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的活性Table 5 ALT activity in serum and liver tissue of alcohol-induced rat model of liver

注:與模型對(duì)照組比較,*代表差異顯著,P<0.05,**代表差異極顯著P<0.01;與五味子鮮果組比較,Δ表示差異顯著,P<0.05;表6同。

表6 酒精性肝損傷大鼠血清及肝組織 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的活性Table 6 AST activity in serum and liver tissue of alcohol-induced rat model of liver

2.5.2 血清及肝組織AST測(cè)定結(jié)果 如表6,與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組大鼠血清及肝組織天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性極顯著增加(P<0.01);與模型對(duì)照組相比,北五味子鮮果組、北五味子發(fā)酵組大鼠血清及肝組織天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性顯著降低(P<0.05),陽性對(duì)照組極顯著降低(P<0.01);與北五味子鮮果組相比,北五味子發(fā)酵組及陽性對(duì)照組大鼠血清及肝組織天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性顯著降低(P<0.05)。

有研究表明[28],機(jī)體的脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激與酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,會(huì)損傷細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破損,釋放出丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST)。ALT幾乎全部存在于肝內(nèi),絕大部分分布在肝細(xì)胞的細(xì)胞漿中,所以當(dāng)肝細(xì)胞受損,細(xì)胞膜通透性增加使肝細(xì)胞中的ALT釋放到血液中,引起血清ALT升高。而AST主要分布在肝臟肝細(xì)胞漿和線粒體中。在正常情況下,僅有極少量ALT和AST釋放到血液中,因此在血清中活性很低;當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí),這兩種酶大量釋放入血,使得血清中ALT和AST活性顯著增高[29]。因此,AST、ALT等指標(biāo)水平的變化成為臨床上評(píng)價(jià)肝損傷最常用的重要指標(biāo)[30]。

實(shí)驗(yàn)使用50%乙醇進(jìn)行灌胃,建立大鼠急性酒精肝損傷模型,觀察北五味子果汁發(fā)酵物的保肝護(hù)肝作用。結(jié)果表明,北五味子鮮果汁組和發(fā)酵果汁組均可以顯著或極顯著的降低大鼠血清和肝臟組織中ALT和AST的活力(P<0.05或P<0.01),說明二者對(duì)酒精所致的大鼠急性肝損傷均具有一定的保護(hù)作用,且發(fā)酵組作用效果要優(yōu)于鮮果組。

3 結(jié)果與討論

本研究首次將生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于天然北五味子果汁的降酸工藝,一定量的北五味子果汁凍干粉末,以1∶20 (W/V)的比例加入蒸餾水,接種菌齡3 d,接種量6%(V∶V),維生素B1濃度10 mg/L,振蕩速度190 r/min,經(jīng)過12 d的發(fā)酵之后將果汁的pH由1.85提高到3.21,滴定酸度從14.9 g/L降低到6.9 g/L,與原果汁相比酸度降低了53.7%,遠(yuǎn)高于目前其他已報(bào)道的北五味子果汁降酸技術(shù)[31];通過初步的化學(xué)成分分析表明,發(fā)酵果汁中多酚和黃酮的含量大幅度下降,而這兩類成分是大多數(shù)植物中構(gòu)成酸性環(huán)境的主要化學(xué)物質(zhì),據(jù)報(bào)道,引起北五味子果汁酸度過高的主要原因也是與這兩類成分相關(guān)[32],因此,這可能是北五味子果汁生物降酸的主要原因[33]。

在食品和健康產(chǎn)品加工過程中引入發(fā)酵環(huán)節(jié)可能會(huì)導(dǎo)致生物安全性等問題,因此本文中選擇的發(fā)酵菌種是衛(wèi)健委規(guī)定的允許在保健食品工業(yè)上使用的藥食同源真菌,生物安全性高、遺傳穩(wěn)定性好、且工藝簡(jiǎn)便、營(yíng)養(yǎng)成分背景清晰,在降酸的同時(shí),果汁中多糖的含量上升約61.5%,提高了北五味子果汁的營(yíng)養(yǎng)附加值。

在藥理活性方面,目前關(guān)于北五味子保肝護(hù)肝活性的研究主要集中于它的干燥果實(shí)及其提取物,其中主要活性物質(zhì)為木脂素和多酚類化合物[34],在本研究中,多酚的含量下降較為明顯,為了探清發(fā)酵過程是否會(huì)降低北五味子果汁的保肝護(hù)肝活性,對(duì)血清和肝組織中AST和ALT的活力進(jìn)行了檢測(cè),并以此結(jié)果為依據(jù)初步表征不同實(shí)驗(yàn)組的保肝護(hù)肝活性;結(jié)果表明,發(fā)酵前后的果汁均能顯著降低血清和肝臟組織中AST和ALT的活力(P<0.05),并沒有因?yàn)槎喾雍康慕档投a(chǎn)生顯著的藥理活性下降。靈芝多糖也具有良好的保肝護(hù)肝活性[35],考慮到發(fā)酵之后果汁中多糖含量的增加,推測(cè)果汁中新增的靈芝多糖類成分可能與其他活性成分起到了協(xié)同預(yù)防酒精肝損傷的作用,該部分內(nèi)容需要進(jìn)一步的深入研究驗(yàn)證。

本文在達(dá)到降酸目的的同時(shí),提高了北五味子獨(dú)特的保健功效,得到的北五味子降酸果汁可以作為多種保健食品和健康產(chǎn)品的原料進(jìn)行開發(fā);在后續(xù)的研究中,北五味子果汁發(fā)酵過程中化學(xué)成分的系統(tǒng)變化分析將有利于闡明其生物降酸的機(jī)理,也為其原料和產(chǎn)品的安全使用提供理論依據(jù)。