菲律賓蛤仔不同組分中重金屬存在形態研究

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(1.大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023; 2.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院,浙江杭州 310016)

菲律賓蛤仔是沿海主要養殖的海產貝類之一[1],味道鮮美且具有較高的營養價值,氨基酸的類別組成及含量比例合理[2]，含有各類維生素及藥用成分以及人體必需的多種微量元素,因此備受青睞。但其因濾食性、活動性差等生活特點易受到如重金屬等污染物的污染[3],重金屬超標的貝類產品不僅會威脅人們的身體健康,還會影響產品的出口貿易制約經濟發展。金屬元素不僅可以溶解狀態存在,還會以顆粒態形式存在[4]。顆粒態重金屬的形成過程是重金屬與有機配位基和形成絡合物的電子供體相結合,因此呈現多種形態,相關研究表明,金屬元素在食品中存在形態對生物吸收利用率產生關鍵影響[5]。不同的存在形態會極大地影響其生物的吸收、利用及體內分布,造成不同的生物效應或產生生理毒害作用[6]。不同存在形態的顆粒態重金屬的結合強度差異較大,因此導致生物效應不同,穩定性強弱依次為可交換態>硫化物結合態>結合態>殘渣態[7]。可交換態金屬對環境的變化最為敏感,且最易被生物體吸收,硫化物結合態是酸可提取態,可交換態金屬和硫化物結合態屬于相對易可給態重金屬;有機物結合態和殘渣態對環境變化不敏感,不易被生物吸收,均屬于惰性態重金屬,且殘渣態對生物無效應[8]。

近年來有關形態分析的報道逐漸增多,如Brezonik等[9]及Foerstner等[10]都對形態分析作了專題討論。逐級化學提取法(SCEE)又稱逐級提取或連續提取,可將復雜體系中不同存在形態的顆粒態重金屬提取出來,便于之后的分析討論[11]。此方法基于Tessier五步連續提取法,根據研究土壤中微量元素存在狀態的方法進行改進而發展起來[12],在定量研究重金屬元素存在狀態的研究中得到了廣泛的應用。根據不同形態元素的溶解度在溶劑中交換強度的差異,將樣品中的顆粒態重金屬依次提取到目標溶液中[13]。選擇合適的重金屬元素提取劑,依次提取可交換態、硫化物結合態、有機物結合態、殘渣態(形態劃分由Siebielec等[14]確立)。提取的各種形態之和應該等于元素的總量[15],所以可由回收率對方法的可行性進行檢測,但是由于城市空氣中存在重金屬的懸浮物,可能會造成提取的一部分重金屬并不全來源于樣品中,所以此方法也存在一定的誤差[16]。許多學者對菲律賓蛤仔和牡蠣中的金屬進行了深入研究,呂永紅[17]的研究證實了各種濃度的鎘離子對菲律賓蛤仔呼吸過程均具有較顯著的抑制作用;孟慧等[18]研究實驗發現牡蠣中鋅的主要存在形態是無機態,且有少量以有機結合態形式存在;蔡立哲等[19]實驗結果顯示,菲律賓蛤仔的鰓和軟體部位的鉛、鋅含量與實驗水體中的鉛、鋅濃度成正比,但鰓對鉛、鋅的積累量較高。仇紅萍[20]對牡蠣的研究中發現牡蠣內臟團中的鎘元素超出國家食品衛生限量標準范圍。

本文將逐級化學提取技術應用到菲律賓蛤仔中重金屬元素的形態研究上,并驗證其可行性。實驗以鉛、鋅、鎘三種重金屬為例研究菲律賓蛤仔中重金屬元素分布及存在形態,將新鮮的菲律賓蛤仔通過差速離心制備成細胞質、細胞核、線粒體三種組分,分別測定這三種組分的鉛、鎘、鋅重金屬含量及存在形態,根據重金屬含量的測定結果得出重金屬在細胞中的分布及存在形態特點,可為以后評估貝類中的重金屬毒性提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的菲律賓蛤仔 體長2～3 cm,采購于大連長興市場;氯化鈉、濃硝酸 天津市大茂化學試劑廠;鉛、鋅、鎘重金屬離子標準溶液 單標,國家有色重金屬及電子材料分析測試中心;氯化鎂、30%過氧化氫 天津市科密歐化學試劑有限公司;超純水 實驗室自制。

FD-1型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;DS-1型高速組織搗碎機 上海標本模型廠;FW高速萬能粉碎機、可調試電陶爐 天津市泰斯特儀器有限公司;GZX-GF型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海龍躍儀器設備有限公司;KQ-C玻璃儀器氣流烘干器 鞏義市予華儀器有限責任公司;Optima 8000 ICP原子發射光譜儀 美國PerkinElmer公司;Milli-Q超純水儀 法國Millipore;AR224CN型電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司;GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘怡實驗儀器開發有限公司;HH-2型數顯恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠;PB-10酸度計 Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 組分制備 將采購的新鮮菲律賓蛤仔先用過濾海水沖凈其表面的淤泥、臟雜物等附著物,選擇殼體無破損、正常活動、大小基本一致的蛤仔放入冰柜冷凍,次日取出,稱取1.5 kg,于室溫稍微解凍后除去外殼,用大張濾紙吸干蛤肉上多余的水分,保留整體蛤肉并稱重,之后將蛤肉剪碎,加入兩倍蛤肉體積的0.75%氯化鈉溶液,用均質機粉碎,粉碎得到的原液進行差速離心,以轉速2000×g離心10 min,沉淀物即為細胞核組分,將上清液繼續以10000×g的離心10 min,上清液即為細胞質組分,沉淀物為線粒體組分,凍干并打粉,于-20 ℃干燥條件下存儲。

1.2.2 重金屬含量測定

1.2.2.1 標準曲線 重金屬標準溶液(儲備液):取1個已泡酸的容量瓶(100 mL),按表1加入重金屬標準液,用HNO3(0.5%)定容,搖勻備用。

表1 金屬標準溶液(儲備液)配制方法Table 1 Preparation method of metal standard solution(stock solution)

重金屬標準溶液(工作液):取7個已泡酸的50 mL石英瓶,分別加入0、1.0、5.0、10.0、18.0、25.0、35.0 mL重金屬標準溶液(儲備液),用0.5%硝酸定容至刻度,搖勻備用。將定容好的重金屬標準液(工作液)用原子發射光譜儀按濃度從低到高依次進行測定,根據測得的強度值與工作液濃度繪制標準曲線。

1.2.2.2 樣品濕法消化 準確稱取細胞質、細胞核、線粒體各0.2 g,分別加入10 mL優級純硝酸于50 mL已泡酸過夜的石英瓶中,于200～300 ℃加熱板上加熱消化2～3 h,若未完全消化或酸液過少,則需補加幾毫升硝酸繼續消化,直至變成透明無色,冷卻后用超純水定容于100 mL的容量瓶內[21],同時做空白實驗。

1.2.2.3 樣品重金屬含量測定 檢測條件為:等離子體氣流量20 L/min;輔助氣流量0.3 L/min;霧化器氣體流量0.24 L/min;蠕動泵轉速:1.0 mL/min。Pb、Zn、Cd這3種重金屬元素的檢測波長分別是:220.35、206.20、228.80 nm。

將樣品消化液用0.45 μm過濾器過濾,并稀釋10倍,進樣前先用0.5%硝酸沖洗系統3～5 min,先對空白樣進行測定。每進一組平行待測樣沖洗一次,每次沖洗2 min,記錄實驗數據。測定結束先用5%硝酸沖洗10 min,再用超純水沖洗10 min,最后將進樣孔暴露于空氣中使整個系統將液體排空。

1.2.2.4 重金屬含量計算 用原子發射光譜儀測出的數據為強度,將強度代入標曲求出X值。

重金屬含量(mg/g)=X×V×A/M

式中：V-容量瓶體積(mL);A-稀釋倍數;M-樣品重量(g);X-溶液濃度值(mg/mL)。

1.2.2.5 可交換態重金屬的提取 準確稱取細胞質、細胞核、線粒體各0.1 g,每個樣品進行三次平行實驗分別加入15 mL 1 mol/L MgCl2溶液,在室溫下振蕩4 h,以 4000 r/min的轉速離心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶內[22]。

1.2.2.6 硫化物結合態重金屬的提取 將離心所得沉淀物分別用10 mL超純水漂洗,以4000 r/min的轉速離心10 min,棄掉上清液,取殘余物分別添加15 mL HNO3溶液,置于100 ℃水浴中加熱30 min,間歇振蕩,以4000 r/min的轉速離心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶中[22]。

1.2.2.7 有機物結合態重金屬的提取 硫化物結合態獲得的沉淀物各用10 mL超純水漂洗,以4000 r/min的轉速離心10 min,將上清液棄掉,取殘余物分別加10 mL超純水,以稀硝酸調節溶液pH至2.0,加入5 mL 30%的H2O2,置于80～85 ℃水浴中加熱約5 h,間歇振蕩,以4000 r/min的轉速離心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶中[22]。

1.2.2.8 殘渣態重金屬的提取 有機物結合態得到的殘余物分別用10 mL超純水漂洗,離心,將上清液棄掉,取殘余物。加入10 mL優級純硝酸于50 mL已泡酸過夜的石英瓶中,于200～300 ℃加熱板上加熱消化2～3 h,若未完全消化或酸液過少,則需補加幾毫升酸液繼續消化,直至變成透明無色,冷卻后用超純水定容于50 mL的容量瓶內,用封口膜纏繞放入冰箱中冷藏。取與消化樣相同量的酸液,按上述步驟做空白試驗[23]。

1.2.2.9 各存在形態金屬含量及回收率測定 采用原子發射光譜法[24]測定提取后各存在形態金屬元素的發射光強度,由工作曲線算出相應的含量[25],具體操作方法同1.2.2.3樣品重金屬含量測定。

各種重金屬回收率計算公式如下:

回收率(%)=重金屬各存在形態含量之和/重金屬總量×100

1.3 數據處理

所有實驗數據均重復測定三次,測定結果為平均值±標準差,進行統計學分析,P<0.05時認為數據具有顯著性差異。實驗數據采用Microsoft Excel 2010軟件進行數據處理、分析與作圖計算各形態在各組分的占比情況,用原子發射光譜儀測出的數據為強度,將強度值代入標曲求出X值,即為各形態在各組分的含量,并計算相應百分比。

2 結果與分析

2.1 分級離心制備細胞核、線粒體和細胞質組分

1.5 kg菲律賓蛤仔得到貝肉重量約為500 g,經過分級離心所得到的細胞核組分凍干粉質量為43.77 g,占比約為46.37%;線粒體組分凍干粉質量為16.08 g,占比約為17.03%;細胞質組分凍干粉質量為34.55 g,占比約為36.60%;其中細胞核組分含量最高,線粒體組分含量最低。

2.2 重金屬在各組分中的含量、回收率及存在形態

2.2.1 重金屬在各組分中的含量

2.2.1.1 鉛標準曲線 標準曲線繪制:鉛含量標準曲線見圖1,標準曲線方程為y=25649x+1568.8,標準曲線決定系數為R2=0.9924。

圖1 金屬鉛標準曲線Fig.1 Standard curve for metallic plumbum

2.2.1.2 鋅標準曲線 標準曲線繪制:鋅含量標準曲線見圖2,標準曲線方程為y=285405x-12153,標準曲線決定系數為R2=0.9919。

圖2 金屬鋅標準曲線Fig.2 Standard curve for metallic zinc

2.2.1.3 鎘標準曲線 標準曲線繪制:鎘含量標準曲線見圖3,標準曲線方程為y=289025x-5159.7,標準曲線決定系數為R2=0.9968。

圖3 金屬鎘標準曲線Fig.3 Standard curve of metallic cadmium

2.2.1.4 重金屬在各組分中的含量計算 三種金屬在三種組分中的含量測定結果如表2所示,鉛和鎘在細胞質中含量最高,鋅主要存在于細胞核和線粒體中。在各組分中,鋅含量均為最高，菲律賓蛤仔是一種富鋅食物。鋅是人體的必需微量元素,每天攝入10～20 mg是對人體有益的，但是當人體每天攝入鋅含量超過40 mg以上,對人體有一定的毒性。與鋅元素不同,鉛和鎘是有毒重金屬,由于樣品含量以干重計算,鉛和鎘元素含量相對生鮮貝類較高。

表2 重金屬在各組分中的含量(干重,mg/g)Table 2 Contents of heavy metal in each component(dry weight,mg/g)

2.2.2 鉛在細胞核、線粒體、細胞質中的存在形態分析 如圖4所示,在細胞核、線粒體、細胞質這三種組分中重金屬鉛主要以硫化物結合態存在,所占的比例分別為75.24%、50.71%和71.29%,其余三種形態均未檢出,說明逐級化學提取技術對貝類中鉛元素存在形態檢測的回收率不高。硫化物結合態是一種易于提取的元素狀態，雖然不如可交換態易于入環境,但比有機物結合態活潑,在一定條件下容易釋放出來的。所以菲律賓蛤仔各組分中的鉛元素相對易于進入環境,易被人體吸收。

圖4 鉛在細胞核、線粒體、細胞質中的存在形態Fig.4 Different forms of metallic plumbum in the nucleus,mitochondria and cytoplasm

2.2.3 鋅在細胞核、線粒體、細胞質中的存在形態分析 如圖5所示,菲律賓蛤仔中的重金屬鋅在四種形態中都存在,其中,在細胞核中鋅的殘渣態含量最高為34.51%,殘渣態重金屬在自然條件下釋放的可能性極小,能長期穩定存在,不易被生物體富集,說明在細胞核鋅元素大部分比較穩定[26]。線粒體中鋅的可交換態、硫化物結合態和殘渣態含量相近。細胞質中鋅主要以可交換態存在,所占比例為35.21%,而交換態是最易被生物體吸收利用的形態,由于生物可利用態的含量最高,所以在細胞質中鋅元素大部分比較活躍[27]。說明鋅元素在菲律賓蛤仔各組分中存在形態相差較大,細胞核中主要以穩定的殘渣態存在,在細胞質中以活潑的可交換態存在。

圖5 鋅在細胞核、線粒體、細胞質中的存在形態Fig.5 Different forms of metallic zinc in the nucleus,mitochondria and cytoplasm

2.2.4 鎘在細胞核、線粒體、細胞質中的存在形態分析 如圖6所示,菲律賓蛤仔中的重金屬鎘主要以可交換態、硫化物結合態和有機物結合態這三種可利用態金屬的形態存在,基本沒有以殘渣態存在的鎘元素,因為殘渣態是最穩定的金屬存在形態,也叫穩定態[28],所以菲律賓蛤仔各細胞器組分中的重金屬鎘沒有最穩定的穩定態。其中鎘在細胞核和線粒體中的形態分布相同,有機物結合態所占比例最高分別為43.03%和40.74%,其次是硫化物結合態,所占比例分別為32.07%和31.57%,可交換態含量較少,分別為23.98%和20.73%。鎘在細胞質中存在形態的分布與細胞核和線粒體中的不同,可交換態含量最高,所占比例為47.38%,說明細胞質中的鎘元素更易釋放到環境中。

圖6 鎘在細胞核、線粒體、細胞質中的存在形態Fig.6 Different forms of metallic cadmium in the nucleus,mitochondria and cytoplasm

從菲律賓蛤仔各組分重金屬存在形態來看,在細胞核和線粒體中,鋅和鎘主要以有機物結合態和殘渣態存在,較穩定,不易釋放;在細胞質中,鉛、鋅和鎘主要以可交換態和硫化物結合態形式存在,易于釋放到環境中,易于被人體吸收。

2.2.5 逐級化學提取法提取重金屬元素回收率 由表3可知,不同重金屬元素在不同組分中回收率不一樣,重金屬元素在不同組分中回收率為50.71%～99.18%。其中Cd回收率最高,回收率為93.04%～99.18%。說明采用逐級化學提取法分析菲律賓蛤仔組分中重金屬存在形態是可行的。

表3 重金屬元素回收率(%)Table 3 Recovery rate of heavy metal element(%)

3 結論

綜上所述,通過差速離心得到細胞質、細胞核、線粒體三種組分,采用原子發射光譜法分析研究三種組分中鉛、鋅、鎘三種重金屬含量及金屬存在形態。結果表明,采用逐級化學提取法分析菲律賓蛤仔細胞核、線粒體、細胞質三種組分中重金屬鉛、鋅、鎘是可行的。菲律賓蛤仔中的重金屬鉛主要以硫化物結合態存在,在一定條件下還是容易釋放到環境中;重金屬鋅在四種形態中都存在,其中鋅在細胞核中的殘渣態含量最高,細胞質中鋅主要以可交換態存在;菲律賓蛤仔中的重金屬鎘主要以可交換態、硫化物結合態和有機物結合態這三種形態存在,基本沒有以殘渣態存在的鎘元素。綜上,菲律賓蛤仔細胞質中鉛、鋅、鎘三種金屬易于釋放;細胞核、線粒體中鋅、鎘兩種元素相對穩定。食品中的重金屬在與生物成分結合后,會形成多種形態,造成毒性的改變,但在實際的人體代謝過程中,其形態是否改變,還有待進一步研究。