HPLC-ELSD法測定長白山篤斯越桔果實中可溶性糖含量

王 瑜,楊浩博,仲 帥,劉 鑫,盛煜鈞,李 彤,宗成文

(延邊大學農學院,吉林延吉 133002)

篤斯越桔(Vacciniumuliginosum)是杜鵑花科越橘屬的多年生落葉灌木,在我國主要分布于黑龍江大、小興安嶺、吉林長白山等地[1-2],是我國重要的野生漿果資源,具有較高的研究價值[3-5]。篤斯越桔果實中不僅含有豐富的花青苷、黃酮醇苷和原花青素等功能活性成分[6],還有大量的糖酸等影響果實口感的風味物質。

果實的品質取決于其可溶性固形物、香味和質地等特性,尤其是糖酸含量和比率[7]。隨著果實成熟,不溶性的淀粉變成可溶性的蔗糖、葡萄糖、果糖等積累于細胞質中,使甜味增加[8]。可溶性糖是衡量果實甜度和風味品質的重要指標[9],也是色素、氨基酸、維生素和芳香物質等其他營養(yǎng)成分合成的基礎原料[10]。關軍鋒[11]研究指出水果中的可溶性糖主要是葡萄糖、果糖和蔗糖。有的水果還含有木糖、山梨醇、甘露醇等[12]。不同種類甚至同一種類不同品種的水果,可溶性糖構成可能存在差異,多數(shù)水果以果糖、蔗糖和葡萄糖中的某一種為主[13]。

果實中可溶性糖的測定方法主要有分光光度法、氣相色譜法、高效毛細管電泳法和高效液相色譜法等[14]。分光光度法儀器設備簡單,操作簡便,但準確度相對不高;氣相色譜在使用前需要對不易揮發(fā)的糖進行衍生化反應,過程繁瑣復雜;高效毛細管電泳法分離較好,但是穩(wěn)定性較差,所測數(shù)據(jù)精密度、重復性不高[15-16];高效液相色譜法的高效性、簡便性、靈敏度以及測試結果的重現(xiàn)性、精密度都很高,近幾年在沙棘[17]、藍果忍冬[18]、黑果醋栗[19]等漿果中廣泛使用。測定可溶性糖含量的檢測器與測定有機酸的檢測器不同,主要有示差折光檢測器(RID)和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)。RID雖然能檢測出糖含量,但是其檢測靈敏度低,受溫度影響大;ELSD其穩(wěn)定性好、靈敏度高、精密度高、無溶劑峰干擾[20-22]。本試驗建立并優(yōu)化HPLC-ELSD法測定篤斯越桔果實可溶性糖含量的方法,比較長白山區(qū)2個不同居群篤斯越桔果實糖含量,篩選出高糖種質,以期為篤斯越桔果實品質評價、生產加工及種質資源保存利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

篤斯越桔成熟果實 以長白山區(qū)的東方紅林場(平均海拔1253 m)和蘭家林場(平均海拔836 m)采集2個不同天然居群(每個居群20個樣本,每兩個樣本間距30 m)共40個(盛花后60 d),在采樣后選擇未受損害的成熟果實留樣速凍置于-20 ℃冰箱中保存,在全部采樣后進行可溶性糖分析;果糖(99.7%)、葡萄糖(98.7%)、蔗糖(99.5%) 北京壇墨質檢-標準物質中心;乙腈 色譜純,天津市賽孚瑞科技有限公司。

Primaide高效液相色譜儀 日本Hitachi有限公司;ELSD3300檢測器 美國Alltech公司;TCL-16G型高速心機 上海安亭科學儀器廠;KQ-250B型超聲波清洗器 總功率750 W、頻率40 kHZ,昆山市超聲儀器有限公司;ME204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件的選擇 在流動相(乙腈∶水=70∶30,V/V)、流速(1.0 mL·min-1)等為最初研究條件下,本試驗優(yōu)化了3個柱溫,分別是30、35和50 ℃;流動相中乙腈比例的增大會影響基線的噪音及各峰的分離度,所以測試了在柱溫(35 ℃)、流速(1.0 mL·min-1)等條件不變的情況下,當流動相中乙腈:水分別為70∶30、75∶25、80∶20 (V/V)時的分離度;ELSD檢測器的漂移管溫度是影響實驗結果的重要參數(shù),本試驗在流動相為乙腈和水的體積比為75∶25,流速為1 mg·min-1,柱溫為35 ℃不變的條件下,設置漂移管溫度為50和80 ℃兩個條件,來檢測是否達到理想的分離效果。

最終確定的色譜條件為:ELSD Alltech 3300檢測器;色譜柱為CAPCELL PAK NH2UG80 S5(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為乙腈-水(75∶25,v∶v);流速1.0 mL·min-1;柱溫35 ℃;漂移管溫度80 ℃;載體為高純N2,流速為1.0 L·min-1;進樣量5 μL。

1.2.2 標準溶液的制備 精密稱取果糖、葡萄糖、蔗糖各100 mg,用超純水溶解并定容于10 mL容量瓶中,搖勻,0.45 μm濾膜過濾,得到可溶性糖混合標準品母液。用超純水稀釋混合標準品母液,得到果糖、葡萄糖、蔗糖質量濃度分別為0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mg·mL-1的一系列混標溶液,放入4 ℃冰箱待測。以可溶性糖質量濃度(mg·mL-1)為橫坐標,峰面積(mV)為縱坐標,建立線性回歸方程。

1.2.3 樣品溶液的制備 精密稱取1 g在蘭家林場采集的篤斯越桔果實,加入5 mL超純水研磨成勻漿,倒入5 mL離心管中,室溫下超聲處理5 min后,12000 r·min-1下離心15 min,收集上清液。濾渣按上述方法再提取一次,合并提取液,用超純水定容至20 mL,0.45 μm水系濾膜過濾,待測。

1.2.4 方法學的考察

1.2.4.1 精密度試驗 將1 mg·mL-1的混合標準品溶液按照1.2.1的色譜條件連續(xù)進樣6次,根據(jù)所得峰面積分別計算精密度及果糖、葡萄糖、蔗糖的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD1)。

1.2.4.2 重復性試驗 取篤斯越桔果實,按1.2.3的樣品溶液的制備方法分別提取6份,分別進樣,計算樣品各可溶性糖峰面積的RSD2。

1.2.5 加標回收率試驗 精確量取1 mL樣品,加入果糖質量濃度為1.25 mg·mL-1和葡萄糖質量濃度為1.0 mg·mL-1的混合標準品溶液0.1 mL;各待測液混合后,用0.45 μm水系濾膜過濾,根據(jù)加入標準品質量濃度與檢出質量濃度來計算回收率,實驗平行6次。

1.2.6 篤斯越桔果實可溶性糖含量的測定 將篤斯越桔果實按照1.2.3的方法制備三份,按照1.2.1的色譜條件進樣分析,根據(jù)峰面積算出篤斯越桔果實中果糖、葡萄糖的含量,并根據(jù)果糖,葡萄糖算出總糖含量。甜度值的計算參照姚改芳等[23]的方法,蔗糖的甜度值為1.00,果糖為1.75,葡萄糖為0.70,甜度值=蔗糖含量×1.00+果糖含量×1.75+葡萄糖含量×0.70。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗三次重復。采用Excel 2010處理原始數(shù)據(jù)以及平均值、標準差的計算。采用SPSS 19.0(IBM Co.,Chicago,IL,USA)進行單因素方差分析、多重比較(Ducan法,P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 柱溫的確定 由圖1可見,隨著柱溫的升高,各組分在色譜柱內的保留時間都有所縮短,但在50 ℃時果糖和葡萄糖分離效果不好,在30 ℃時,蔗糖有雜峰,且沒有從基線分離出來,故選擇35 ℃作為柱溫。

圖1 不同柱溫下可溶性糖的色譜圖Fig.1 Chromatograms of soluble sugars under different column temperature注:A:柱溫為30 ℃;B:柱溫為35 ℃;C:柱溫為50 ℃。

2.1.2 流動相比例的確定 由圖2可知,提高乙腈的比例可以更好的提高糖的分離程度,當流動相乙腈和水體積比為75∶25時,相鄰兩峰分離效果較好,且分離時間較短,在10 min以內就可以分析一個樣品,綜合考慮保留時間及分離度,采用乙腈和水的體積比為75∶25作為流動相。

圖2 乙腈和水不同體積比的可溶性糖色譜圖Fig.2 Chromatogram of soluble sugars in different volume ratio of CH3CN and H2O注:A:乙腈和水的體積比為70∶30;B:乙腈和水的 體積比為75∶25;C:乙腈和水的體積比為80∶20。

2.1.3 漂移管溫度的確定 漂移管溫度會影響檢測器的靈敏度。根據(jù)文獻指出由于漂移管溫度過低時流動相蒸發(fā)不完全,導致基線噪音上升,分離不完全;溫度過高時流動相又會完全蒸發(fā),導致信噪比增大[21]。所以最佳溫度需要通過觀察各溫度時信噪比和分離度來確定。如圖3,漂移管溫度為50 ℃,果糖和葡萄糖沒有達到基線分離,綜合考慮選擇漂移管溫度為80 ℃。

圖3 不同漂移管溫度下可溶性糖的色譜圖Fig.3 Chromatogram of soluble sugars in different drift tube temperature注：A:漂移管溫度為50 ℃；B:漂移管溫度為80 ℃。

2.2 HPLC圖譜分析

取果糖、葡萄糖、蔗糖標準品的混標溶液,進樣5 μL,色譜圖見圖4A。由圖4A可以看出,3種可溶性糖基本達到基線分離,峰形良好。取篤斯越桔樣品溶液,進樣5 μL,色譜圖見圖4B。由圖4B可知,篤斯越桔果實中主要含有果糖、葡萄糖,兩種糖分離度較好。并沒有檢測出蔗糖及其他可溶性糖,這與對越桔糖酸組分及含量分析中的可溶性糖主要有果糖和葡萄糖為主的研究結果大致相同[24],與張英春等[16]報道不同的是,本試驗沒有檢測出蔗糖,這可能與大興安嶺地區(qū)與長白山地區(qū)生長環(huán)境以及遺傳與其他環(huán)境因素多因素共同作用的結果[25-27]。

2.3 方法學考察

2.3.1 方法的回歸方程、精密度和重復性試驗結果 表1的結果顯示,通過將混合標準品溶液稀釋的6個濃度梯度(0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mg·mL-1)所成的線性相關系數(shù)在0.9994～0.9995之間,說明糖酸組分的峰面積與含量的線性關系良好。糖組分測定的RSD1在1.08%～2.09%之間,RSD2在0.80%～2.73%之間,表明該方法重復性良好,所用儀器的精密度良好。

表1 糖組分的線性回歸方程及精密度和重復性(n=6)Table 1 Linearity,precision and repeatability determination of sugar(n=6)

表2 可溶性糖測定的回收率實驗(n=6)Table 2 Recovery rates of soluble sugars in spiked samples(n=6)

圖4 優(yōu)化條件下糖標準品(A)及樣品(B)色譜圖Fig.4 The sugars standard(A)and sample(B) chromatograms under optimization conditions

2.3.2 回收率試驗結果 兩種可溶性糖的平均回收率為102.83%和106.29%,表明方法準確率高。結果如表2所示。

2.4 不同居群長白山篤斯越桔果實中糖含量

篤斯越桔果實內果糖含量最多,其次為葡萄糖。表3方差分析結果顯示,篤斯越桔果實中的果糖、葡萄糖、總糖和甜度值在不同居群間差異達到了極顯著水平(P<0.01)。

不同居群內可溶性糖含量顯著(P<0.05)(表4),海拔高的東方紅林場果糖、葡萄糖和總糖的平均含量高于蘭家林場,東方紅林場的平均甜度值達到85.33,遠高于蘭家林場的56.61。DFH-11(東方紅居群內第11個樣本)的果糖含量顯著高于居群內其他19個樣本(P<0.05);DFH-11和DFH-14的葡萄糖含量顯著高于居群內其他樣本(P<0.05),總糖含量最高的是DFH-11,為89.37 mg·g-1FW,含量最低的是DFH-16,僅有38.79 mg·g-1FW。東方紅林場內甜度最高的是DFH-11,高達110.77。蘭家林場中LJ-6樣本果糖、葡萄糖和總糖含量顯著(P<0.05)高于居群內其他樣本;甜度值最高的是LJ-6樣本,為88.63,但與東方紅林場的DFH-11樣本相比,低了22.14。因此DFH-11具有潛在的應用前景,是長白山篤斯越桔育種工作的首選材料。

表3 不同居群篤斯越桔果實可溶性糖含量的方差分析Table 3 The ANOVA analysis of soluble sugar content in Vaccinium uliginosum fruits from different populations

表4 不同居群篤斯越桔果實可溶性糖含量的多重比較Table 4 Multiple comparison of soluble sugar content in Vaccinium uliginosum fruits from different populations

3 結論

本試驗采用HPLC-ELSD法對長白山區(qū)不同居群篤斯越桔果實可溶性糖含量進行測定,并建立優(yōu)化建立穩(wěn)定準確的色譜條件。結果顯示,HPLC-ELSD法簡便快捷,靈敏度高,能夠準確測定出篤斯越桔果實中可溶性糖含量。長白山篤斯越桔果實糖分主要為果糖和葡萄糖。2個居群中海拔高的東方紅林場的果糖、葡萄糖、總糖含量及甜度值明顯高于海拔低蘭家林場。居群內糖含量及甜度值差異顯著,2個居群40個樣本中DFH-11的總糖含量及甜度值最高,具有潛在的應用前景,是長白山篤斯越桔育種工作的首選材料。劉玉蘭[28]指出總糖對釀酒葡萄的品質、口感以及深加工有很大影響,可見本試驗為高效利用優(yōu)異種質資源提供理論依據(jù),對篤斯越桔資源開發(fā)利用和保護有重要意義。

續(xù)表

注:不同小寫字母代表相同林場相同指標差異達顯著水平(P<0.05)。