UPLC-Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用鑒別摻假蜂蜜

謝 博1,2,3,傅 紅2,3,楊 方

(1.福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,福建福州 350001; 2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建福州 350108; 3.福州大學(xué)福建省海洋酶工程重點實驗室,福建福州 350108)

蜂蜜富含豐富的礦物質(zhì)、維生素、單糖、酶、氨基酸及其他酸類物質(zhì),具有抗菌消炎、抗氧化等多種生物活性,是天然的保健食品,也因此受到廣大消費者的青睞[1-2]。然而,我國的很多蜂農(nóng)和廠家受經(jīng)濟利益的驅(qū)使,向蜂蜜中添加外源糖漿、將低等蜂蜜摻入高等蜂蜜中以次充好,使得蜂蜜品質(zhì)參差不齊,嚴重阻礙了蜂蜜市場的監(jiān)管與管理[3]。

目前對于摻假蜂蜜的檢測主要集中在糖類物質(zhì)的研究。可根據(jù)摻入蜂蜜中糖漿的不同采取不同的檢測方法,采用液相色譜-同位素比值質(zhì)譜法、傅里葉變換近紅外光譜分析法、拉曼光譜、熒光光譜、核磁共振、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法、薄層色譜法(TLC)等方法檢測蜂蜜中C-3、C-4糖的含量,或是研究蜂蜜中C-3/C-4的比值[4-10]。但這些方法有的特異性高,一種方法只能檢測摻入一種糖漿的蜂蜜,具有一定的局限性;有的方法操作復(fù)雜,耗時長,成本大,靈敏度低。除了以糖作為檢測物質(zhì)判定蜂蜜真假之外,因蜂蜜中含有約0.1%～0.5%的蛋白類物質(zhì),以蛋白類物質(zhì)作為標準物檢測蜂蜜真?zhèn)我渤蔀閷W(xué)者們研究的新方向[11]。蜂蜜中加入糖漿或不同蜜源蜂蜜的混合會使原蜂蜜的蛋白豐度降低,或者原蜂蜜中可能存在外源性蜜源蛋白。Zhang等[12]基于兩種抗蜂王漿主要蛋白1(MRJP1)的特異性多克隆抗體(POAB),研制了一種快速金夾心免疫層析條(GSIS),該方法可快速檢測蜂蜜摻假。鄧建軍等[13]對不同蜂蜜進行SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析發(fā)現(xiàn),摻假蜂蜜蛋白質(zhì)含量明顯低于真蜂蜜。蜂蜜中氨基酸的種類和含量與其來源密切相關(guān),根據(jù)氨基酸的差異不僅可以區(qū)分蜂蜜的來源,還可衡量蜂蜜是否摻假[14]。Iglesias等[15]和Nisbet等[16]發(fā)現(xiàn)蜂蜜中脯氨酸含量≥180 mg/kg,且已將脯氨酸含量用作評價蜂蜜成熟度和蜂蜜摻假的標準。

多肽的特異性強,通過多肽定位的蛋白質(zhì)可直接反映源物質(zhì)的特點,因此從多肽的角度出發(fā)研究摻假食品已成為當今學(xué)者關(guān)注的熱點。周廣運等[17]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定出了5種豬肉中存在的特異性多肽,可用于肉品摻假的鑒定。陽洪波等[18]采用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)篩選出了3種豬源性膠原蛋白特征肽段,4種牛源性膠原蛋白特征肽段,1種羊源性膠原蛋白特征肽段,可用作膠原蛋白的鑒定。房芳等[19]采用鳥槍蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了可以鑒別阿膠及其他物種膠原蛋白的特異性肽段。但采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定摻假蜂蜜的報道較少。

本研究以UPLC-Q-Exactive聯(lián)用的方法對2種摻假蜂蜜,4種未摻假蜂蜜胰蛋白酶酶解之后的肽段進行分析,通過檢索Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫得出多肽的序列及來源,對比摻假蜂蜜和未摻假蜂蜜多肽的區(qū)別,并篩選4種未摻假蜂蜜中共有而摻假蜂蜜中未檢測到的肽段,為以蛋白類物質(zhì)為基礎(chǔ)研究蜂蜜摻假提供依據(jù)與實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4種未摻假蜂蜜分別為棗花蜜、槐花蜜、金銀花蜜、椴樹蜜 均購自北京中蜜科技發(fā)展有限公司;2種摻假蜂蜜分別編號為1530和6344 經(jīng)福建省出入境檢驗檢疫技術(shù)中心同位素質(zhì)譜鑒定,C-4糖含量分別為36.5%(1530)、68%(6344),C-4糖含量大于7%即視為摻假蜂蜜;三氯乙酸、碳酸氫銨為分析純 購自國藥集團產(chǎn)品;Tris 生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品;二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、碘乙酰胺(IAA)、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonium)-1-propanesulfonate,CHAPS) 美國Bio-Rad公司;胰蛋白酶 質(zhì)譜測序級,乙腈、甲酸、甲醇 色譜純,Thermo Fisher公司;C18固相萃取柱(3 mL,500 mg) 美國Supelco公司。

DIONEX UltiMate 3000超高效液相色譜 美國Dionex公司產(chǎn)品;四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Q-Exactive) 美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品;UV-2700紫外-可見分光度計 日本島津儀器有限公司產(chǎn)品;CR21N臺式冷凍離心機 日立公司產(chǎn)品;FreeZone?TriadTM2.5 L冷凍干燥機 美國LABCONCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂蜜蛋白提取 稱取蜂蜜約5 g溶于20%三氯乙酸(TCA)水溶液中,置于-20 ℃冰箱沉淀30 min。將溶液在4 ℃以5000 r/min離心10 min,棄去上清液。10 mL超純水洗滌沉淀,再次離心。重復(fù)洗滌步驟,將最終的沉淀物溶解在2 mL超純水中,冷凍后凍干[20]。

1.2.2 蜂蜜蛋白的紫外光譜掃描 用蒸餾水配制1 mg/mL蛋白質(zhì)提取物溶液,取1 mL加入5 mL考馬斯亮藍,考馬斯亮藍與蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物。溫育2 min后,用紫外光譜儀進行全波長掃描[21]。

1.2.3 胰蛋白酶酶解 稱取20 μg胰蛋白酶,加入20 μL 50 mmol/L乙酸溶解,配制成1 mg/mL溶液,用100 mmol/L Tris稀釋至0.01 mg/mL。凍干蛋白質(zhì)用 100 mmol/L NH4HCO3緩沖溶液(pH=7.4,含8 mol/L尿素)復(fù)溶,取質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋白溶液0.1 mL,加入DTT使其終濃度為20 mmol/L,于60 ℃水浴1 h后加入IAA使其終濃度為40 mmol/L,室溫避光放置30 min后加入100 mmol/L NH4HCO3緩沖溶液使尿素終濃度≤1 mol/L,加入100 μL胰蛋白酶溶液,37 ℃酶解20～24 h。沸水浴10 min滅酶活,10000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清液備用[17]。

1.2.4 凈化 C18SPE柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化。取1.2.3中得到的上清液3 mL過柱,用3 mL甲醇洗脫,重復(fù)3～4次,收集洗脫液。45 ℃氮吹至近干,用1 mL的0.1%甲酸水溶液溶解,過0.45 μm濾膜,待測。

1.2.5 測定條件

1.2.5.1 色譜條件 Hypersil GOLD UPLC C18色譜柱,1.9 μm×100 mm×2.1 mm;柱溫:30 ℃;流動相:A:0.1%甲酸水,B:乙腈,梯度洗脫程序:0～50 min(10%～90% B),50～55 min(90% B),55～56 min(90%～10% B),56～60 min(10% B);流速:0.2 mL/min;進樣量:10 μL。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件 掃描模式：Full MS/dd-MS2，分析時長60 min，檢測方式：正離子，母離子掃描范圍：100～1500 m/z，一級質(zhì)譜分辨率:70000，AGC目標：le6，一級最大離子注入時間：100 ms，掃描范圍數(shù)量：1，動態(tài)排除：40.0 s一次，MS2激活類型：HCD，質(zhì)荷比窗口寬度：0.4 m/z，二級質(zhì)譜分辨率：17500，微掃描次數(shù)：1，二級最大離子注入時間：50 ms，碰撞能量：30 eV，底部填充率：0.1%。

電噴霧離子源(ESI);載氣為高純氮氣(純度>99.5%),鞘氣流速40個單位(arb),輔氣流速15個單位(arb),吹掃氣流速0個單位;噴霧電壓3.2 kV;碰撞池采用梯度碰撞能量:25%、35%、55%;毛細管溫度320 ℃,離子透鏡電壓頻率(S-lens RF level)為60,輔氣熱源溫度350 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MaxQuant(版1.6.1.0)進行數(shù)據(jù)分析。搜索是針對來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniport的蜂蜜(uniprot-apis.fasta)的67051種蛋白質(zhì)序列(2018年4月17日下載,https://www.uniprot.org/)。具體搜索參數(shù)為:蛋白假陽性率FDR設(shè)置為0.01;最小氨基酸長度設(shè)置為3;可變修飾設(shè)為N端乙酰化(N-Acetyl)、甲硫氨酸殘基氧化(Oxidation(M));半胱氨酸固定化修飾設(shè)置為氨基甲酰化(Carbamidomethyl(C));酶為胰蛋白酶,最大裂解丟失設(shè)置為2,所有常見的污染物和相反的命中被刪除[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜蛋白紫外光譜掃描結(jié)果

以4種未摻假蜂蜜中的椴樹蜂蜜為例,2種摻假蜂蜜1530和6344以考馬斯亮藍G-250溶液進行染色后,在500～650 nm處進行全波長掃描,所得結(jié)果如圖1所示。考馬斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色,最大吸收在488 nm,當與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈青藍色,所形成的結(jié)合物在595 nm有最大吸收。從圖1可以看出椴樹蜂蜜在595 nm處有最大吸收,說明采用三氯乙酸沉淀法可以有效提取出椴樹蜂蜜蛋白。而1530和6344在595 nm處曲線呈扁平狀,吸收峰不明顯,說明1530和6344蜂蜜中蛋白含量相對較少,這可能是因為摻入外源糖漿使原蜂蜜蛋白濃度減少。通過蜂蜜蛋白含量可區(qū)分蜂蜜來源及品質(zhì),Chen等[23]根據(jù)蜂蜜蛋白質(zhì)含量區(qū)分中國臺灣蜂蜜和泰國龍眼蜂蜜。Dong等[7]選取了35個不能從中提取蛋白質(zhì)的蜂蜜,通過同位素鑒定為C-4糖或C-3糖摻假。由此可見,蜂蜜中能否提出蛋白質(zhì),提出蛋白質(zhì)含量的多少可間接反映蜂蜜的品質(zhì)及其是否摻假。

圖1 真?zhèn)畏涿鄣鞍坠庾V掃描Fig.1 Spectral scanning of true and false honey protein

2.2 蜂蜜蛋白酶解結(jié)果

4種蜂蜜和2種摻假蜂蜜經(jīng)1.2.1方法提取蜂蜜蛋白后,胰蛋白酶酶解,UPLC-Q-Exactive分析后的基峰色譜圖如圖2所示,峰的強度均在109,說明樣品濃度較好,其中椴樹蜜、槐花蜜、金銀花蜜、棗花蜜的基峰色譜圖表現(xiàn)出一定的相似性,6344和1530蜂蜜的基峰色譜圖表現(xiàn)出一定的相似性,摻假蜂蜜和未摻假蜂蜜兩組峰形相差較大。LC-MS/MS鑒定所得數(shù)據(jù)在Maxquant軟件上進行分析,Maxquant軟件可根據(jù)所得質(zhì)譜圖與蛋白數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列進行比對,并給出分數(shù),分數(shù)越高,Unique peptides越多,所得肽段越可信。肽段在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot上進行Blast,可得多肽來源信息,去除評分較低及其他污染物的多肽,所得結(jié)果見表1～表6。

棗花蜜(表1)共鑒定出30條肽段,其中11條是蜂王漿主要蛋白(MRJPs)中MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP4酶解的肽段,9條來自于未標記蛋白(Uncharacterized protein),其余10種是蜜蜂中的細菌(Bartonellaapis、Lactobacilluskunkeei、AscosphaeraapisARSEF 7405)中的酶及蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生的肽段。

槐花蜜(表2)共鑒定到17條多肽,其中4條來自于蜂王漿主要蛋白1(MRJP1)和蜂王漿主要蛋白3(MRJP3),其他多肽來自于蜜蜂中存在的酶及未標記蛋白。

金銀花蜜(表3)共鑒定出15條多肽,其中1條來自于蜂王漿主要蛋白1(MRJP1),7條來自于意大利蜜蜂中存在的未標記蛋白(Uncharacterized protein),剩余的7條多肽來自于蜜蜂中存在的酶以及受體蛋白等。

圖2 4種蜂蜜與2種摻假蜂蜜酶解產(chǎn)物的LC-MS/MS總離子流圖(TIC)Fig.2 LC-MS/MS total ion flow charts(TIC)of four honeys and two adulterated honey hydrolysates注：從上向下依次是椴樹蜜、槐花蜜、金銀花蜜、棗花蜜、6344、1530。

表1 棗花蜜酶解肽段序列Table 1 Sequences of enzymatic hydrolysis peptides in jujube honey

表2 槐花蜜酶解肽段序列Table 2 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of Sophora japonica honey

表3 金銀花蜜酶解肽段序列Table 3 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of honeysuckle honey

椴樹蜜(表4)共鑒定出18條多肽,其中4條來自于蜂王漿主要蛋白(MRJPs),2條來自于葡萄糖苷酶(Alpha-glucosidase),7條來自于未標記蛋白,1條來自于葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase),葡萄糖氧化酶可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸內(nèi)酯,然后水解成葡萄糖酸,且其產(chǎn)生的過氧化氫具有殺菌作用[15]。

6344蜂蜜(表5)共鑒定出3條多肽,主要來源于蜂蜜中細菌體內(nèi)存在的蛋白,如Bartonellaapis(蜜蜂巴爾通體菌)的鉬蛋白鉬轉(zhuǎn)移酶、AscosphaeraapisARSEF 7405(蜜蜂球囊菌ARSEF 7405)姐妹染色單體內(nèi)聚因子等。

1530蜂蜜(表6)共鑒定出5條多肽,主要來自于意大利蜂蜜的未標記蛋白、TATA-結(jié)合蛋白相關(guān)因子、含PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白等。兩種蜂蜜均未鑒定出來自于蜂王漿主要蛋白的多肽。

表4 椴樹蜂蜜酶解肽段序列Table 4 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of tilia honey

表5 6344酶解肽段序列Table 5 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of 6344

表6 1530酶解肽段序列Table 6 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of 1530

表7 6種蜂蜜多肽生物來源分析Table 7 Biological sources of 6 honey peptides

注:蜜蜂指Apisceranacerana、Apiscerana、Apismellifera。

2.3 多肽來源分析

從多肽的生物來源分析4種未摻假蜂蜜和2種摻假蜂蜜可以看出(表7),棗花蜜、槐花蜜、金銀花蜜、椴樹蜜有80%的多肽來自于蜜蜂(Apisceranacerana、Apiscerana、Apismellifera),其余20%主要來自蜂蜜中存在的一些細菌,四種未摻假蜂蜜均存在唯一肽段(Unique peptide)大于2的蛋白酶解產(chǎn)生的肽段,而摻假蜂蜜1530中雖然檢測到了來自蜜蜂Apisceranacerana的多肽,但其對應(yīng)的蛋白的唯一肽段(Unique peptide)為1,可信度不高。摻假較為嚴重的摻假蜂蜜6344(C-4含量為68%)中未檢測到來自于蜜蜂(Apisceranacerana、Apiscerana、Apismellifera)的多肽。

從多肽的蛋白來源分析,4種未摻假蜂蜜中均不同程度的鑒定到來自MRJPs的多肽,而2種摻假蜂蜜均未檢測出來自MRJPs的多肽。其中,蜂王漿主要蛋白1(MRJP1)是大量存在于蜂蜜中的蛋白[1]。4種未摻假蜂蜜均檢測到了來自MRJP1的肽段,但摻假蜂蜜未檢測出。其他學(xué)者也有類似的發(fā)現(xiàn),Bilikova等[24]便以MRJP1為抗原制備抗體,采用酶聯(lián)免疫吸附的方法快速檢測摻假蜂蜜,并具有較好的準確性。Won等[25]采用MALDI-TOF鑒定出不同蜜蜂所產(chǎn)的MRJP1存在一定的差異,可以有效區(qū)分不同蜂蜜品種,摻假蜂蜜因摻入了外源糖漿和蜂蜜,蛋白質(zhì)種類及含量會有所變化,通過區(qū)分摻假蜂蜜和未摻假蜂蜜的MRJP1同樣可以鑒定摻假蜂蜜。由此可見,MRJP1或可能作為鑒定摻假蜂蜜的潛在標志物。

表8 肽段EYILVLSNK Maxquant分析結(jié)果Table 8 Analysis results of peptide EYILVLSNK by Maxquant

圖3 MRJP1氨基酸排列圖Fig.3 Amino acid alignment of MRJP1

2.4 差異性多肽的篩選

除了水分和糖之外,蜂蜜蛋白及其酶解多肽是蜂蜜的第三重要成分,蜂蜜的品質(zhì)應(yīng)根據(jù)其含有的蛋白質(zhì)及多肽來確定,其中首先要關(guān)注的便是將花蜜轉(zhuǎn)化為蜂蜜的酶及其酶解產(chǎn)物,其次便是蜂蜜中存在的蜂王漿主要蛋白[24]。另一方面,不同品種的蜂蜜含有各自的特征蛋白及其酶解肽段,也含有區(qū)別于其它食物的共同的蛋白及其酶解肽段,特征蛋白及其酶解肽段可以區(qū)別蜂蜜的種類,共同蛋白及其酶解肽段則可用來區(qū)別蜂蜜和其他食物,因此,也可用來區(qū)分未摻假蜂蜜和摻假蜂蜜。基于此,本研究對比了6種蜂蜜酶解后多肽序列發(fā)現(xiàn),4種未摻假蜂蜜中均存在來自于MRJP1的多肽EYILVLSNK,本研究中的2種摻假蜂蜜中未檢測到,且這條肽段所對應(yīng)的蛋白質(zhì)(MRJP1)是蜂蜜中的高豐度蛋白。將篩選到的多肽EYILVLSNK在Uniprot上進行蛋白質(zhì)Blast,所得結(jié)果見圖3,該多肽存在于MRJP1第376～384位,其生物詳細信息見表8。由表8可以看出鑒定出的MRJP1含有2個唯一肽段(Unique peptide),且分數(shù)為117.39,表明該肽段及其所對應(yīng)的MRJP1可信度較高。因此,多肽EYILVLSNK可區(qū)分本研究中的4種未摻假蜂蜜和2種摻假蜂蜜,也可作為鑒定摻假蜂蜜的潛在特異性多肽。

3 討論與結(jié)論

蜂蜜摻假是目前蜂蜜市場上普遍存在的問題,快捷準確的辨別方法對于鑒定蜂蜜摻假具有重要意義。基于蛋白類物質(zhì)來鑒定蜂蜜摻假主要集中在三個方面:a.分析蜂蜜中氨基酸的種類與含量以確定蜂蜜的來源以及是否摻假[11];b.分析蜂蜜中蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳行為差異以確定蜂蜜的差異[10,23];c.通過蜂蜜蛋白的免疫特性差異來區(qū)分蜂蜜來源及是否摻假[20,23]。這些方法具有一定的缺點,蜂蜜中氨基酸的種類和含量受地理、蜜源、氣候等多種因素影響具有不穩(wěn)定性[26];蜂蜜蛋白的電泳行為只能粗略的表現(xiàn)出不同蜂蜜蛋白的差異,無法精確定位差異蛋白;蜂蜜蛋白的免疫特性雖然可以有效區(qū)分不同蜂蜜,但是操作復(fù)雜,無法適應(yīng)要求快速檢測摻假蜂蜜的市場。蜂蜜中含有一定量的蛋白質(zhì),且不同蜂蜜蛋白質(zhì)的含量和種類也存在差異,通過酶解蛋白,液相質(zhì)譜鑒定的手段可直接得出蜂蜜多肽信息,不僅可以反映蜂蜜是否摻假,而且可以快速準確定位摻假蜂蜜和未摻假蜂蜜的差異蛋白,進而鑒定摻假蜂蜜。

本研究采用UPLC-Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析鑒定了4種未摻假蜂蜜及兩種摻假蜂蜜多肽的組成及結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,4種未摻假蜂蜜80%以上的肽段來自蜜蜂(Apisceranacerana、Apiscerana、Apismellifera),且含有蜂蜜中大量存在的蜂王漿主要蛋白家族(MRJPs)酶解產(chǎn)生的肽段,2種摻假蜂蜜中未檢測出來自MRJPs酶解產(chǎn)生的多肽,且所有檢測到的多肽對應(yīng)的蛋白的唯一肽段(Unique peptides)為1,可信度不高。對比六種蜂蜜蛋白酶解結(jié)果發(fā)現(xiàn),4種未摻假蜂蜜中均檢測到了來自蜂王漿主要蛋白1(MRJP1)的多肽EYILVLSNK,該多肽對應(yīng)的蛋白的唯一肽段(Unique peptides)為2,可信度較高,2種摻假蜂蜜中未檢測到多肽EYILVLSNK,多肽EYILVLSNK作為摻假蜂蜜和未摻假蜂蜜的差異肽段,可辨別本研究中的真?zhèn)畏涿?或可作為鑒定摻假蜂蜜的潛在特異性多肽。這一結(jié)果不僅為基于蛋白類物質(zhì)辨別蜂蜜真?zhèn)翁峁嶒灮A(chǔ),而且為鑒定摻假蜂蜜提供新的思路。