茶氨酸聯合γ-氨基丁酸改善CUMS大鼠抑郁癥狀的研究

周 月,付 敏,劉 歡

(天津醫科大學公共衛生學院,天津 300070)

抑郁癥是一種廣泛存在的慢性疾病,可影響思想、情緒和身體健康。它的特點是情緒低落、缺乏活力、悲傷、失眠、無法享受生活[1]。據估計,在全球范圍內,有將近3.5億人患有抑郁癥[2],其中許多人在接受了推薦的抗抑郁藥物和心理治療后仍未得到緩解[3]。如今,市場上的抗抑郁藥存在著不良反應大、起效緩慢、療效不盡人意等缺點[4]。所以除了傳統抗抑郁藥物的使用,從植物中尋找安全、高效的天然產物來改善和防治抑郁癥已成為社會需求和研究熱點。

近年來,天然產物在抗抑郁方面的應用研究成為熱門課題,涉及的天然產物有大葉蒟、百合、花椒、酸棗仁和羅布麻等40多種,其有效成分主要為黃酮類、生物堿、多酚類化合物等。有研究發現柴胡中的主要成分柴胡皂苷可降低海馬中JNK、Bad蛋白表達控制慢性不可預知溫和刺激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)大鼠的抑郁癥狀[5]。酸棗仁中的有效成分酸棗仁總生物堿、酸棗仁皂苷以及酸棗仁總黃酮也有一定的抗抑郁作用,如酸棗仁總生物堿可縮短小鼠懸尾的不動時間[6]。羅布麻葉總黃酮提取物可提高CUMS大鼠曠場運動水平[7]。植物中的天然產物以其無毒安全、抗抑郁療效顯著等優勢,也是篩選抗抑郁新藥的重要資源。

我國茶葉資源豐富,茶葉中主要活性成分如茶多酚、茶色素、茶多糖等,已被證實具有抗腫瘤、抗氧化、改善心血管疾病等一系列特殊保健功能[8],動物實驗發現普洱茶茶色素的主要成分——茶褐素能夠抑制高糖飲食大鼠血糖升高及體重增加[9]。茶葉中含有的L-茶氨酸(L-Theanine)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)也有很好的醫用保健價值。L-茶氨酸是茶葉中含有的一種特殊的非蛋白質氨基酸[10],對大鼠具有顯著的抗焦慮作用[11],可顯著降低小鼠強迫游泳試驗和懸尾試驗中的不動時間[12],提高CUMS大鼠腦組織中單胺類神經遞質的濃度改善抑郁癥狀[13-14]。

GABA是一個四碳非蛋白質氨基酸,廣泛存在于動物、植物和微生物中[15],是一種介導抗癲癇藥物、抗焦慮藥物、鎮靜藥物、抗驚厥藥物、肌肉遲緩藥物的多功能藥物作用的重要靶標[16]。近年來的研究發現GABA的組織濃度與老年認知有關[17],在組織中合成,攝取和釋放受損與慢性應激引起的抑郁樣行為有關[18],具有高水平GABA的新型茶可降低小鼠強迫游泳試驗和懸尾試驗中的不動時間[19-20]。

目前尚無關于L-茶氨酸和GABA兩者聯合干預防治抑郁癥的研究,因此本研究建立CUMS抑郁大鼠模型進行聯合干預,分析其行為學變化及血清和腦組織中單胺類神經遞質等指標。評價L-茶氨酸和GABA的聯合抗抑郁作用,為天然產物抗抑郁提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級SD大鼠 50只,雄性,體重220～240 g,8周齡,由北京維通利華實驗動物有限公司提供,實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2016-0006號,實驗動物飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所動物實驗中心,溫度長期控制在20～25 ℃,相對濕度維持在55%～65%。所有實驗大鼠在實驗開始前于動物房中適應性喂養1周,不限制飼料和水的攝入;基礎飼料(純化飼料) 由南通特洛菲飼料科技有限公司提供;茶氨酸、GABA混合物 由湯臣倍健股份有限公司提供;混合物包括(實驗方法分組劑量中標注的GABA和茶氨酸的劑量為有效成分的實際含量):GABA單品(純度95%)、茶氨酸單品(純度20%)、輔料(微晶纖維素、無水乳糖、交聯羧甲基纖維素鈉)作為無任何抗抑郁作用的填充劑、崩解劑、助流劑、西酞普蘭 美國Sigma公司;BCA法蛋白質檢測試劑盒 南京建成科技有限公司;BDNF Elisa試劑盒、IL-6 Elisa試劑盒、β-內啡肽Elisa試劑盒 武漢華美生物科技有限公司;多巴胺標準品、五羥色胺標準品、去甲腎上腺素標準品 上海源葉生物科技有限公司。

OFT-100大小鼠開場活動實驗系統 成都泰盟軟件有限公司;TM-Vision行為學實驗系統 成都泰盟軟件有限公司;Bio-Tek SynergyMx多功能酶標儀 美國Bio-Tek寶特;3-18 k離心機 美國Sigma公司;-80 ℃低溫冰箱 海爾集團;UltiMate 3000高效液相色譜儀 美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及干預方法 大鼠適應性飼養結束后根據體重分層隨機分為正常對照組(對照組)、CUMS模型組(模型組)、CUMS+低劑量組(低劑量組)、CUMS+高劑量組(高劑量組)和CUMS+西酞普蘭組(西酞普蘭組),每組10只。

對照組和模型組灌胃生理鹽水;低劑量組灌胃劑量(茶氨酸15 mg/kg/d+GABA 20 mg/kg/d);高劑量組灌胃劑量(茶氨酸45 mg/kg/d+GABA 60 mg/kg/d);西酞普蘭組灌胃劑量10 mg/kg/d。灌胃體積均為10 mL/kg/d。

1.2.2 模型建立 本實驗以CUMS進行抑郁模型的建立,采用的刺激包括:禁食或禁水24 h/次,4 ℃冰水游泳5 min/次,墊料潮濕8 h/次,束縛籠束縛2 h/次,止血鉗夾尾1 min/次,噪聲刺激2 h/次,晝夜顛倒24 h/次。除對照組大鼠以外其余四組均每日隨機給予2種刺激。

1.2.3 實驗時間 大鼠給予CUMS刺激第1 d記為實驗的第1 d,第1 d慢性刺激前大鼠內眥取血。模型建立第45 d取血并進行糖水偏好實驗和曠場實驗,記為實驗第45 d。第46 d開始進行灌胃藥物干預,45 d后進行糖水偏好實驗和曠場實驗,最后取血和腦組織,記為實驗第90 d。

圖1 實驗方法及過程時間流程圖Fig.1 Flow chart of experimental method and process time

1.2.4 體重記錄 實驗的第1、45、90 d,對所有組別大鼠禁食12 h,禁食完后稱量體重并記錄。最后分別計算出第1～45 d、45～90 d各組體重增量。

1.2.5 糖水偏好實驗 每次糖水偏好實驗需要4 d,首先將大鼠置于隔噪音、安靜的房間內訓練適應含糖飲水1 d,每籠每只大鼠同時放置兩個裝有2%蔗糖水的500 mL水瓶。第2 d給予每只大鼠500 mL/瓶的2%蔗糖水和500 mL/瓶的純凈水。后1 d禁食禁水。最后1 d,進行動物的糖水消耗實驗,同時給予每只大鼠預先定量好的100 mL/瓶的2%蔗糖水和100 mL/瓶的純凈水,2 h后測量糖水消耗量及其純凈水消耗量,并計算動物的糖水偏好[糖水偏好率(%)=糖水消耗/總液體消耗]。

1.2.6 曠場實驗 在實驗的第45、90 d各進行一次曠場實驗。每次實驗前讓大鼠在安靜環境中適應2 h,實驗裝置為625 mm(L)×740 mm(W)×510 mm(H)四周底面全部涂黑的箱子,實驗在安靜環境下進行,將一只大鼠小心置于箱底中心,記錄組別,用攝像系統觀察并記錄5 min內大鼠的活動情況。觀察指標包括水平運動-運動距離;垂直運動-站立次數:前肢離開水平地面高度1 cm以上的次數。每次做完后用90%的乙醇溶液清理實驗箱,清除上一只大鼠的氣味,尿液及其糞便。

1.2.7 血清和腦組織中五羥色胺和多巴胺含量的檢測 采用高效液相色譜-熒光法(HPLC-FD):將血液于室溫條件下放置2 h,12000×g離心l0 min,取上清液進行100 μL加入等體積的5%(v/v)高氯酸溶液,4 ℃ 12000×g離心10 min,將上清液取出在相同條件下再離心10 min取上清液過0.22 μm濾膜上樣分析。每mg腦組織加入20 μL的0.1 mol/L的HClO4,用細胞破碎儀混勻,4 ℃ 20000×g離心20 min,取500 μL上清液,加125 μL的0.5 mol/L的Na2CO3,4 ℃ 20000×g離心10 min,過0.22 μm濾膜上樣分析。

色譜條件:色譜柱選用反相色譜YMC-pack-ODS-a(100 mm×4.0 mm,3 μm);流動相:0.l mol/L磷酸二氫鉀/甲醇(85∶15,V/V)溶液;流速:0.75 mL/min;熒光檢測激發波長和發射波長分別為278、338 nm;進樣量:20 μL;室溫下測定。

1.2.8 血清和腦組織中白介素-6、腦源性神經營養因子(BDNF)和β-內啡肽含量的檢測 采用酶聯免疫吸附法(Elisa):腦組織用PBS洗去血污剪成小塊,每100 mg腦組織加入1 mL PBS制成勻漿,然后4 ℃ 5000×g離心10 min取上清進行測定。按照Elisa試劑盒說明書要求檢測腦組織和血清中IL-6、BDNF、β-內啡肽的含量。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 體重變化

體重變化可以反映大鼠食欲情況,抑郁可引起大鼠厭食,進而導致體重下降。如表1所示,1～45 d CUMS刺激組大鼠體重增量顯著低于對照組(P<0.05),說明大鼠進食減少,出現厭食、消瘦的抑郁癥狀，造模成功。45～90 d高、低劑量干預組和西酞普蘭組大鼠體重增量顯著高于模型組(P<0.05),高劑量組體重增量大于低劑量組(P<0.05),與西酞普蘭組無明顯差異(P>0.05)。說明L-茶氨酸和GABA聯合干預可提高大鼠食欲,增加體重增長速度。

表1 各組大鼠體重增量比較(n=10)Table 1 Weight increment of rats in each group(n=10)

注:*:與對照組相比,P<0.05;#:與模型組相比,P<0.05;&:與低劑量組相比,P<0.05;Δ:與西酞普蘭組相比,P<0.05；表2～表8同。

2.2 糖水偏好實驗

糖水偏好實驗模擬人類幸福感快感,是反映大鼠快感的有效指標,是檢驗大鼠抑郁模型是否造模成功的專業指標。由表2可知,第45 d時,與對照組相比,CUMS處理組大鼠糖水偏好程度顯著降低(P<0.05),說明CUMS刺激顯著降低大鼠糖水偏好程度,大鼠造模成功。第90 d高、低劑量組、西酞普蘭組糖水偏好程度顯著高于模型組(P<0.05),說明L-茶氨酸和GABA聯合干預可提高大鼠的糖水偏好程度,改善抑郁癥狀;且高劑量組糖水偏好程度顯著高于低劑量組(P<0.05),與西酞普蘭組之間沒有顯著差異(P>0.05),說明L-茶氨酸和GABA高劑量抗抑郁作用更為顯著,與抗抑郁藥物西酞普蘭療效無差異。

表2 各組大鼠糖水偏好程度比較(n=10)Table 2 Comparison of sugar and water preference of rats(n=10)

2.3 曠場實驗

曠場實驗可以反映大鼠活動及對新鮮環境的好奇度,其中水平運動反映大鼠運動活動度水平,垂直運動反映其對外界新鮮環境的好奇探測程度和欲望程度。由表3可知CUMS刺激后第45 d,各組水平運動和垂直運動水平均低于對照組(P<0.05),說明慢性刺激后大鼠曠場試驗的水平運動和垂直運動均明顯降低。

表3 各組大鼠曠場實驗運動距離和站立次數比較(n=10)Table 3 Comparison of the distance of exercise and the number of standing times in the open field test of rats(n=10)

表4 各組大鼠血清、腦組織5-HT含量比較(n=10)Table 4 Comparison of 5-HT contents in serum or brain tissue of rats(n=10)

第90 d,與模型組比較,高、低劑量組、西酞普蘭組大鼠水平運動距離和垂直運動的站立次數均顯著增長(P<0.05),且高劑量組站立次數高于低劑量組(P<0.05)，與西酞普蘭組差異無統計學意義(P>0.05),說明L-茶氨酸和GABA聯合干預可增加CUMS抑郁大鼠曠場實驗的運動距離和站立次數,提升對外界環境的好奇程度,改善抑郁行為。

2.4 腦組織和血清中單胺類神經遞質的含量

如表4、表5所示，第45 d,各組與對照組相比血清中5-HT、DA水平均明顯降低(P<0.05)。說明抑郁模型建立后大鼠體內5-HT、DA水平降低。

表4中第90 d,與模型組相比,高、低劑量組和西酞普蘭組血清5-HT水平顯著升高(P<0.05),高劑量組與西酞普蘭組血清5-HT水平相比無明顯差異(P>0.05);高劑量組和西酞普蘭組腦組織中的5-HT水平顯著高于模型組(P<0.05),且高劑量組的5-HT水平顯著高于低劑量組(P<0.05),高劑量組與西酞普蘭組腦組織的5-HT水平相比也無明顯差異(P>0.05)。

第90 d(表5),與模型組相比，高、低劑量組和西酞普蘭組血清DA水平顯著升高(P<0.05),腦組織中的DA水平有顯著升高(P<0.05);高劑量組與西酞普蘭組血清和腦組織中的5-HT、DA水平相比均無明顯差異(P>0.05)。說明L-茶氨酸和GABA聯合作用可升高抑郁大鼠體內5-HT、DA的水平。

表5 各組大鼠血清、腦組織DA含量比較(n=10)Table 5 Comparison of DA contents in serum or brain tissue of rats(n=10)

2.5 腦組織和血清中IL-6、BDNF、β-內啡肽的含量

第45 d,與對照組比較,接受CUMS刺激各組血清IL-6水平顯著升高,BDNF和β-內啡肽水平明顯降低,差別具有統計學意義(P<0.05),說明CUMS刺激造成的抑郁癥狀,可升高大鼠體內炎癥因子水平,降低BDNF和β-內啡肽水平，見表6～表8。

第90 d,高、低劑量組和西酞普蘭組血清中的IL-6含量低于模型組(P<0.05),BDNF和β-內啡肽含量高于模型組(P<0.05);且高劑量組血清中的IL-6含量低于低劑量組(P<0.05),BDNF和β-內啡肽含量高于低劑量組(P<0.05),而高劑量組與西酞普蘭組的IL-6、BDNF、β-內啡肽含量相比差異無統計學意義(P>0.05)。腦組織中的結果與血清中的一致。說明L-茶氨酸和GABA聯合作用可降低抑郁大鼠體內的IL-6水平,升高BDNF和β-內啡肽水平。

表6 各組大鼠血清、腦組織IL-6含量比較Table 6 Comparison of serum or brain tissue IL-6 contents of

表7 各組大鼠血清、腦組織BDNF含量比較Table 7 Comparison of serum or brain tissue BDNF contents of

表8 各組大鼠血清和腦組織β-EP含量比較Table 8 Comparison of serum or brain tissue β-EP contents in of

3 討論與結論

本研究發現CUMS抑郁大鼠在L-茶氨酸和GABA聯合干預后,高低劑量組大鼠的抑郁行為均有所改善,與模型組相比體重增長、糖水偏好程度升高、曠場實驗的運動距離和站立次數均增加,表明大鼠食欲有所恢復、幸福感和快感回升、對新鮮環境的好奇程度提高,說明L-茶氨酸和GABA聯合干預有改善抑郁的作用。

目前研究表明L-茶氨酸改善CUMS大鼠抑郁癥狀的最低灌胃劑量20 mg/kg/d[13-14]。有GABA對慢性應激大鼠認知功能的研究中使用的劑量為500 mg/kg/d,大鼠在電迷宮實驗中表現為潛伏期時間明顯低于模型組[21]。本研究中低劑量組為(L-茶氨酸15 mg/kg/d+GABA 20 mg/kg/d),其中L-茶氨酸低于其他文獻中最低作用劑量20 mg/kg/d,但仍表現出了緩解抑郁的作用,說明GABA協同L-茶氨酸改善了CUMS大鼠的抑郁癥狀。高劑量組為(L-茶氨酸45 mg/kg/d+GABA 60 mg/kg/d),GABA的干預劑量遠遠低于其他研究中的500 mg/kg/d,同樣說明L-茶氨酸和GABA對改善大鼠抑郁行為具有協同增效作用。西酞普蘭是一種高選擇性的5-羥色胺再攝取抑制劑,是臨床治療抑郁癥的常規藥物[22],常做為抗抑郁研究的陽性對照[23-25]。L-茶氨酸+GABA高劑量組與西酞普蘭組大鼠的糖水偏好程度、體重增量、曠場實驗的運動距離和站立次數均無明顯差異,說明高劑量的L-茶氨酸聯合GABA抗抑郁作用顯著。

單胺類神經遞質5-HT、DA在中樞神經系統中起著非常重要的作用,單胺假說的主要內容是腦內單胺類神經遞質缺乏與抑郁癥的發病密切相關[26]。本研究發現CUMS大鼠血清及腦組織5-HT、DA水平降低,L-茶氨酸和GABA聯合干預后水平上升且高低劑量組差異顯著,說明L-茶氨酸和GABA聯合干預改善抑郁癥狀與提高體內單胺類神經遞質水平有關。

神經遞質水平的改變可能為L-茶氨酸和GABA直接或間接影響造成。有研究發現L-茶氨酸通過血腦屏障進入腦組織后,紋狀體、下丘腦和海馬中的5-HT和DA濃度顯著增加[27],腦缺血再灌注損傷模型大鼠在茶氨酸干預后,皮質GABA含量顯著升高[28],L-茶氨酸預防喹啉酸誘導的運動功能障礙和紋狀體神經毒性的實驗中L-茶氨酸干預大鼠紋狀體5-HT、DA和GABA濃度均顯著升高[29],而GABA與5-HT、DA之間均具有相互正向調節作用[30]。

白介素-6(interleukin-6,IL-6)、腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和β-內啡肽(β-endorphin,β-EP)也是評價抑郁癥的重要指標。抑郁癥患者IL-6濃度顯著高于正常健康人[31]。藥物治療使脾臟IL-6生成減少[32]。BDNF是保護性免疫因子,重度抑郁癥患者血清BDNF水平較低[33],而通過抗抑郁藥治療,可提高BDNF水平[34]。β-EP作為主要的內阿片樣物質,參與欣快、報酬行為等情緒調節活動。電針抗抑郁研究中,CUMS大鼠血清β-EP水平降低,電針治療后含量升高,抑郁行為改善[35]。IL-6、BDNF、β-EP之間存在一定調節關系。有研究證明了BDNF對IL-6的負向調節作用[36],β-EP可介導對免疫功能的負向調節,下調分泌增多的促炎性細胞因子及免疫介質[37]。IL-6、BDNF、β-EP對單胺類神經遞質水平也有一定的影響。腦室內注射細胞因子可降低大鼠額葉皮質5-HT含量,中腦和紋狀體內5-HT及其代謝產物5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)都減少[38]。BDNF的下調可增加海馬神經元對傷害性應激的敏感性,引起神經毒性從而導致海馬神經元的萎縮甚至死亡[39],間接對單胺類神經遞質產生影響;向小鼠腦室注入β-EP能增加體內5-HT的含量[40]。本研究發現L-茶氨酸和GABA聯合干預后,大鼠血清、腦組織中IL-6水平降低,BDNF、β-EP升高。IL-6炎癥反應降低可能影響5-HT系統受損修復。神經元、神經膠質細胞分泌BDNF增加降低神經毒性可能對5-HT、DA的合成產生影響,其免疫保護作用也影響了細胞因子IL-6的水平。β-EP含量升高可能影響5-HT的含量,降低促炎癥性細胞因子IL-6的水平。L-茶氨酸和GABA可通過影響IL-6、BDNF、β-EP水平,增加大鼠體內單胺類神經遞質濃度。

前人研究中L-茶氨酸、GABA對慢性應激大鼠抗抑郁的相關實驗應用的劑量遠高于本研究,且為單一成分[13,21]。檢驗指標只限于腦組織中單胺神經遞質水平[13],或GABA受體和免疫陽性細胞數量[21]。本研究從大鼠體重增量、糖水偏好程度、曠場實驗行為學方面和大鼠血清、腦組織中神經遞質含量,體內神經營養因子及炎癥水平多個角度探索L-茶氨酸和GABA聯合作用機制驗證其對抑郁癥狀的有效緩解作用,發現L-茶氨酸和GABA聯合干預對CUMS誘發的抑郁癥有一定改善作用,且高劑量的作用更為顯著,作用機制可能為兩者聯合增加大鼠體內單胺類神經遞質濃度,升高BDNF、β-內啡肽含量,降低炎癥水平來發揮抗抑郁作用。