東北刺人參抗疲勞及改善睡眠節律作用研究

王艷艷,翟春梅,申柯欣,米 曉,黃莉莉,孟永海,李廷利

(黑龍江中醫藥大學藥學院,黑龍江哈爾濱 150040)

東北刺人參(OplopanaxelatusNakai.)為五加科刺參屬，多年生落葉灌木,又名刺參、刺人參、長白山刺人參等,以根入藥,有補氣助陽、強心利尿的功效,收載于《中國植物志》[1]。東北刺人參主要分布于我國的吉林省長白山地區、朝鮮北部山區以及俄羅斯遠東山區[2]。現代藥理學研究發現,東北刺人參與人參的生物活性極為相似,都具有很高的藥用價值,且安全性高、無毒副作用,在民間可替代人參應用,有“木本人參”的美譽[3]。

東北刺人參具有廣泛的生物活性,其在臨床上被用于治療慢性疲勞綜合癥、神經衰弱、心血管疾病、糖尿病等多種疾病。胡彥武[4]用不同劑量東北刺人參莖給正常小鼠連續灌胃14 d,測定其負重游泳時間、耐缺氧時間、血乳酸含量,結果顯示,東北刺人參莖能延長小鼠的耐缺氧時間和負重游泳時間,降低小鼠血乳酸含量。然而,目前國內外對東北刺人參根的抗疲勞作用的實驗研究較少。因此,本文建立小鼠力竭游泳模型,分別考察東北刺人參根對小鼠負重游泳時間以及自由泳小鼠GSH-Px、LDH、ATPase和BUN等指標的影響。

本實驗室前期研究發現,東北刺人參具有顯著的改善睡眠作用,其作用機制與調節中樞神經遞質含量有關[5],但東北刺人參對睡眠節律的影響尚未可知。本文結合以往研究,以野生型Canton S品系黑腹果蠅為觀察對象[6],利用果蠅活動監測系統DAMS,研究東北刺人參根水提取物凍干粉對7日齡黑腹果蠅睡眠節律的干預作用，初步探討東北刺人參改善睡眠質量及抗疲勞的作用,為東北刺人參生物活性的基礎研究以及人工栽培品的應用及產品開發提供參考[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR小鼠 雌雄各半,體重(20±2) g,SPF級,均由黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心提供,許可證號:SCXK(黑)2013-004;野生型Canton S品系黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster) 7日齡,256只,雌雄各半,由北京大學生命科學學院提供;東北刺人參根 產自吉林省集安市野生藥材種植基地,秋季采收,將其根洗凈、切段、晾干、粉碎(過二號篩)、備用,經黑龍江中醫藥大學王振月教授鑒定為東北刺人參的根;蔗糖 分析純,天津市濱海科迪化學試劑有限公司;瓊脂 細菌學級,賽國生物科技有限責任公司;丙酸 分析純,天津市福晨化學試劑廠;乙醇 分析純,天津市富宇精細化工有限公司;酵母粉 食品級,英國OXOID公司;玉米粉 食品級,興化聯富食品有限公司;尿素氮測試盒(BUN)、乳酸脫氫酶測試盒(LDH)、考馬斯亮藍測試盒、谷胱甘肽-過氧化物酶測試盒(GSH-Px)、三磷酸腺苷測試盒(ATP) 以上試劑盒均產自南京建成成生物工程研究所。

N-1100D型旋轉蒸發儀、FDU-1200型冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司;FJ-200高速萬能粉碎機 上海申勝儀器公司;HH. WZ. CY600電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備公司;AL 204電子天平 美國METTLER TOLEDO公司;EVOLUTION 260紫外分光光度計 美國Thermo公司;DAMS果蠅活動監測系統 Trikinetics Inc.Waltham,MA;EPOCH12酶標儀 美國BIOTEK公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 東北刺人參提取物溶液的制備 稱取東北刺人參根粉末(過二號篩)200 g,分別用10倍量和8倍量體積的蒸餾水加熱回流提取2次,每次1.5 h,合并提取液,過濾,50 ℃減壓濃縮至1 mg/mL,冷凍干燥,得東北刺人參根水提取物凍干粉,備用。

1.2.2 小鼠實驗環境 將ICR小鼠置于獨立通氣籠中飼養(噪音≤55 dB(A),換氣次數:20～50 次/h,潔凈度:100級,壓差≥10 Pa,菌落數≤1 個/皿·時);外界溫度(24±2) ℃,濕度55%±15%,光照強度:300 lux,12 h/12 h明暗交替(7:00～19:00光照;19:00～次日7:00黑暗)。

1.2.3 小鼠力竭游泳實驗

1.2.3.1 實驗分組及給藥 選取ICR小鼠,置于實驗環境中適應一周。隨機分組,雌雄各半,分別為空白對照組,東北刺人參根凍干粉高、中、低劑量組(500、250、125 mg/kg),灌胃給藥;空白組動物給予生理鹽水溶液,給藥容積為0.2 mL/10 g體重;連續給藥15 d,末次給藥后進行各項抗疲勞指標測定。

1.2.3.2 負重小鼠游泳時間的測定 力竭游泳實驗中,將小鼠隨機分成4組(空白對照組,東北刺人參根凍干粉高、中、低劑量組),每組12只,雌雄各半。末次灌胃給藥30 min后,以小鼠體重的5%稱取鉛絲,在其尾根部負重,置于(25±1) ℃的恒溫水箱(60 cm×40 cm×40 cm)中進行游泳,力竭標志為小鼠頭部完全沒入水中8 s不再浮起記錄此時的負重游泳時間。期間可適時使用玻璃棒撥動小鼠,使其始終處于運動狀態及避免抱團,但不可干擾其運動,記錄小鼠從進入水中至游泳力竭的時間并計算延長率，延長率(%)=[(給藥組平均負重游泳時間-空白組平均負重游泳時間)/空白組平均負重游泳時間]×100。

1.2.3.3 抗疲勞生理指標的測定 另取一批小鼠,隨機分組,每組12只,雌雄各半,末次灌胃給藥30 min后稱重,頸椎脫臼處死,進行各項抗疲勞生理指標測定。

臟器指數:小鼠稱重,處死,解剖取出脾臟、胸腺并用生理鹽水洗去血液,濾紙吸干表面水分,分別稱重,計算臟器指數。臟器指數(mg/g)=臟器重量/體重。

血清BUN含量和LDH活性的測定:小鼠不負重游泳90 min后,立即撈出小鼠,剪去胡須,摘眼球取血,靜置,3000 r/min離心10 min,分離血清,4 ℃保存。參照血尿素氮測試盒、乳酸脫氫酶測試盒說明書方法,結合紫外可見光分光光度計測量血清BUN的含量及LDH活力。

GSH-Px、ATPase活力(Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase)的測定:小鼠處死,解剖取出肝臟,預冷的生理鹽水洗去血液,冰浴中制成10%肝勻漿。參照谷胱甘肽過氧化物酶測試盒和三磷酸腺苷測試盒說明書操作測定上述指標。

1.2.4 果蠅睡眠實驗

1.2.4.1 果蠅實驗環境 果蠅飼養于果蠅培養室中,通風、避光,采用自動定時光控系統對果蠅生活環境實行每天12 h的明暗光照周期處理,實驗溫度為(24±1) ℃,相對濕度為50%～60%。

1.2.4.2 果蠅培養基制備 培養基制備的配制參照卞宏生等[8]文獻。在基礎培養基配方基礎上加入東北刺人參根凍干粉,按照文獻方法制備成濃度分別為0.500%、0.250%、0.125%、0.0625%、0.0313%的含藥培養基,完全凝固后,倒置于操作臺面上,備用。

1.2.4.3 實驗分組 以7日齡野生型Canton S品系黑腹果蠅作為觀察對象。收集8 h內羽化未交配的果蠅,CO2輕微麻醉后區分雌、雄,分為空白組和東北刺人參給藥組,每組32只。將新生果蠅置于相應環境中,基礎培養基中培養3 d后,分別移入含基礎培養基和含藥培養基(0.500%、0.250%、0.125%、0.0625%、0.0313%)的監測管中,連續給藥4 d,記錄第7 d上午7:00至第8 d上午7:00雌雄果蠅的睡眠時間;同理,將新生果蠅培養3 d后,分別移入含基礎培養基和含藥培養基(0.500%、0.125%、0.0313%)的監測管中,記錄雌雄果蠅的睡眠發生次數、自主活動次數及睡眠覺醒節律。

1.2.4.4 果蠅24 h睡眠覺醒節律監測 采用DAMS儀,監測果蠅早7:00至次日早7:00的睡眠。通過DAMS數據采集軟件每隔5 min自動記錄一次果蠅活動次數,連續記錄的24 h。若5 min內活動次數記錄為零,即果蠅靜止時間持續5 min以上時,此休息狀態符合睡眠行為標準,認為果蠅處于睡眠狀態,記為果蠅睡眠時間[8]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 小鼠力竭游泳時間

游泳時間是小鼠運動耐力的體現,是衡量藥物抗疲勞作用的重要指標[9]。由表1可知,與空白組相比，東北刺人參高、中、低劑量組小鼠游泳時間均延長,其中東北刺人參高劑量組負重游泳時間增加具有統計學意義(P<0.05)。結果表明,東北刺人參能延長負重小鼠游泳時間,增強其抗疲勞能力。

表1 東北刺人參對負重小鼠力竭游泳時間的影響Table 1 Effects of Oplopanax elatus on swimming time of mice

注:“*”表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05);“**”表示與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01);表2～表6同。

2.2 對臟器指數的影響

由表2可見,與空白對照組相比,各給藥組小鼠的胸腺系數均大于空白對照組,但無統計學意義。刺人參凍干粉高、低劑量組的小鼠脾臟系數有增高趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05)。結果表明,東北刺人參具有一定增強機體免疫功能的作用。

表2 東北刺人參對游泳小鼠臟器指數的影響Table 2 Effects of Oplopanax elatus on viscera indices of mice

2.3 對血清BUN和LDH含量的影響

本實驗的結果表明,各給藥組小鼠血清BUN含量與空白對照組相比均降低,且東北刺人參凍干粉高劑量組的血清BUN降低的含量具有統計學意義(P<0.05),即說明了東北刺人參可以抑制或減少小鼠血尿素氮的產生,提高其抗疲勞能力[10]。同理,與空白對照組相比,刺人參凍干粉高劑量組的LDH活性升高有統計學意義(P<0.05)。結果表明,東北刺人參能提高游泳小鼠LDH活性,延緩疲勞產生或加速乳酸消除作用[10]。

表3 東北刺人參對游泳小鼠血BUN和LDH含量的影響Table 3 Effects of Oplopanax elatus on BUN and LDH content of mice

2.4 對GSH-Px活性的影響

由表4可知,與空白對照組相比,各給藥組小鼠GSH-Px活性均升高,其中,刺人參凍干粉高劑量組的GSH活性升高有統計學意義(P<0.05)。實驗結果表明,東北刺人參干預后小鼠的GSH-Px活性升高,提示刺人參與人參相似,可以減少自由基的堆積,加快體內脂質過氧化物的清除。

表4 東北刺人參對游泳小鼠GSH-Px 活性的影響Table 4 Effects of Oplopanax elatus on GSH-Px activity of swimming mice

2.5 對ATPase活力的影響

實驗結果如表5所示,與空白對照組相比,刺人參凍干粉高劑量組的Ca2+-Mg2+-ATPase活力升高有統計學意義(P<0.05),提示東北刺人參能增加力竭游泳小鼠肝臟中Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的含量,具有保護線粒體氧化磷酸化的作用[11]。

表5 東北刺人參對小鼠ATPase活力的影響Table 5 Effects of Oplopanax elatus on ATPase activity of mice

2.6 東北刺人參對果蠅睡眠時間的影響

由圖1可知,與空白對照組相比,給藥濃度為0.5000%、0.2500%、0.1250%、0.0625%和0.0313%組的東北刺人參對雄果蠅全天睡眠時間增加有極顯著性影響(P<0.01);給藥濃度為0.2500%和0.1250%組極顯著降低雌果蠅的全天睡眠時間(P<0.01),其他各組無統計學意義。白天睡眠時間的影響結果顯示,與空白組比較,各組雄果蠅白天睡眠時間增加有極顯著影響(P<0.01);除0.0625%組與空白組比較無統計學意義外,其余各組均可不同程度減少雌果蠅白天睡眠時間。夜晚睡眠時間的影響結果顯示,給藥濃度為0.5000%和0.2500%組可不同程度增加雄果蠅夜晚睡眠時間,給藥濃度為0.5000%和0.0313%組可極顯著增加雌果蠅夜晚睡眠時間(P<0.01)。上述結果顯示,東北刺人參能夠顯著延長雄果蠅的全天和白天睡眠時間,而雌果蠅白天睡眠時間顯著減少。

圖1 東北刺人參對7日齡果蠅平均睡眠-覺醒周期的影響Fig.1 Effects of Oplopanax elatus on average sleep-awakening of 7-day Drosophila注:“*”表示與空白對照組相比差異顯著升高(P<0.05); “**”表示與空白對照組相比差異極顯著升高(P<0.01); “#”表示與空白對照組相比差異顯著降低(P<0.05); “##”表示與空白對照組相比差異 極顯著降低(P<0.01)；圖2同。

2.7 東北刺人參對7日齡果蠅睡眠發生次數的影響

由圖2可知,與空白組比較,給藥濃度為0.500%、0.125%和0.0313% 組的東北刺人參對雄果蠅的全天夜晚平均睡眠發生次數增加有極顯著性影響(P<0.01),各給藥組對雌果蠅的全天平均睡眠發生次數的影響無顯著性意義;白天平均睡眠發生次數的影響結果顯示,與空白組比較,0.5000%、0.1250%和0.0313%組與空白組比較雄果蠅的平均睡眠發生次數增加均有極顯著差異(P<0.01),但各組不同程度減少雌果蠅白天平均睡眠發生次數;夜晚平均睡眠發生次數的影響結果顯示,各給藥組對雄果蠅的夜晚平均睡眠發生次數的影響無顯著性意義;給藥濃度為0.5000%和0.0313%組可極顯著增加雌果蠅夜晚平均睡眠發生次數(P<0.01)。上述結果顯示,東北刺人參能夠顯著增加雄果蠅的全天和白天平均睡眠發生次數,而對雌果蠅的影響體現在減少白天平均睡眠發生次數,增加夜晚平均睡眠發生次數。

圖3 不同濃度東北刺人參干預后果蠅睡眠-覺醒圖Fig.3 Effects of Oplopanax elatus on sleep-awakening of Drosophila注:圖中白色部分表示活動,黑色部分表示睡眠。

圖2 東北刺人參對果蠅平均睡眠發生次數的影響Fig.2 Effects of Oplopanax elatus on average number of sleeps of Drosophila

2.8 東北刺人參對7日齡果蠅自主活動的影響

由表6可知,與空白組比較,給藥濃度為0.125%和0.0313%的東北刺人參對雄果蠅的自主活動次數降低有顯著性影響(P<0.05或P<0.01),0.500%和0.0313%組減少雌果蠅的自主活動次數具有極顯著意義(P<0.01)。

表6 東北刺人參對果蠅平均自主活動次數的影響Table 6 Effects of Oplopanax elatus on autonomic activity of Drosophila

2.9 東北刺人參對果蠅睡眠-覺醒節律改變的干預作用

由圖3分析可知,不同濃度的東北刺人參主要是通過增加雄果蠅白天和夜晚睡眠時間,減少片段化睡眠,延長總睡眠時間。同時,其對雌果蠅睡眠的影響主要體現在減少白天活動時間,縮短果蠅片段化睡眠,增加夜晚睡眠時間,且明顯后移睡眠相位角,這種作用以給藥濃度為0.5000%最為明顯。

3 結論與討論

國內外文獻報道,人參皂苷類成分具有顯著的抗疲勞和抗應激作用[12-14]。東北刺人參與人參的生物活性相似,有學者報道東北刺人參莖能延長小鼠的耐缺氧時間和負重游泳時間,降低小鼠血乳酸含量。本實驗考察了東北刺人參根的抗疲勞活性,研究顯示,東北刺人參可顯著延長負重小鼠的力竭游泳時間,提高運動耐力;東北刺人參能夠降低BUN的含量,抑制體內蛋白質分解代謝及支鏈氨基酸代謝過程,緩解疲勞的發生;東北刺人參高劑量組小鼠LDH的含量均高于空白對照組,這表明其有助于提高乳酸脫氫酶的活性,延緩疲勞產生或加速乳酸消除作用[15-16];東北刺人參干預后小鼠的GSH-Px活性升高,表明其與人參相似,可以減少自由基的堆積,加快體內脂質過氧化物的清除[17];藥物干預后小鼠的Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶含量均高于空白對照組,這表明了刺人參具有保護線粒體氧化磷酸化功能作用[18-19]。上述結果表明,東北刺人參根可以延長小鼠力竭游泳時間,提高其運動耐力,增加臟器指數,降低小鼠BUN含量,提高小鼠LDH與GSH活力,提高Ca2+-Mg2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性,減少自由基的堆積,加快體內代謝產物的清除,發揮延緩疲勞的作用。

東北刺人參具有顯著的改善睡眠作用,本實驗考察了其對睡眠節律的影響。研究結果顯示,東北刺人參根對果蠅睡眠-覺醒節律調節的最佳給藥濃度為0.5000%,該藥物能夠顯著延長雄果蠅的全天、白天平均睡眠時間和平均睡眠發生次數,減少自主活動次數,而雌果蠅白天睡眠時間顯著減少,夜晚睡眠時間增加。通過分析藥物干預前后睡眠-覺醒圖我們發現,12/12 h明暗交替組的果蠅往往在19:00熄燈前后陸續出現睡眠狀態,在次日6:00左右覺醒,而給予藥物后的雌果蠅覺醒時間延遲至18:00

左右。這一現象在近日生理學中稱為睡眠時相后移,而這種研究果蠅整體節律特點的方法,稱為群體節律研究[20]。上述結果提示,東北刺人參根可以增加果蠅睡眠時間,減少自主活動次數,縮短片段化睡眠,且明顯后移睡眠相位角,改善睡眠質量。

綜上所述,東北刺人參根具有改善睡眠質量及抗疲勞的作用,但其發揮上述作用的物質基礎和作用機制還有待進一步研究。東北刺人參具有廣闊的開發前景,其生物活性的基礎研究及人工栽培品的應用值得進一步探索。