食品中修飾型真菌毒素及其同時檢測方法研究進展

趙瓊暉,袁梓洢+,王宏菊,張建瑩

(深圳海關食品檢驗檢疫技術中心,廣東深圳 518045)

食品在生產、貯存、運輸、分配及加工過程中易被外源物污染,從而導致食品安全問題。真菌毒素是常見的污染物之一,它是真菌產生的有毒次級代謝產物,對人體和動物具有三致作用、免疫抑制作用和雌激素效應等[1-2]。目前,很多國家和地區對食品中真菌毒素設定了限量。我國食品安全國家標準《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2017)規定了食品中黃曲霉毒素B1(aflatoxins B1,AFB1)、黃曲霉毒素M1(aflatoxins M1,AFM1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)及玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)等限量[3]。

修飾型真菌毒素是真菌毒素在微生物[4]、植物[5]或動物[6]中經代謝或修飾作用而生成的代謝或修飾產物,也包括食品加工過程中產生的各種產物。目前研究并未確證修飾型真菌毒素的毒性比原型毒素更大,但大量研究表明修飾型真菌毒素進入人或動物體內會被水解并釋放出原型毒素,成為潛在的風險毒素[7-8]。一般地,食品更易受到多種修飾型真菌毒素或/和真菌毒素的侵染,而多種毒素共存可能會導致毒性附加或/和協同效應[9-10]。

圖1 修飾型真菌毒素的分類Fig.1 The taxonomy of modified mycotoxins

因此對多種修飾型真菌毒素的同時檢測尤為必要。不過,修飾型真菌毒素比其原型毒素的極性強,在常規的提取、凈化、檢測過程中易被漏檢[11],所以人們常低估食品中毒素的總含量。因此,監測食品中修飾型真菌毒素的存在情況仍是確保食品安全和人及動物健康的重要任務。本文綜述了食品中修飾型毒素的形成和種類、毒性性質及同時檢測方法,以期為進一步研究食品中修飾型真菌毒素的存在情況、代謝特點和同時檢測技術提供一定的理論參考。

1 修飾型真菌毒素的形成及種類

修飾型毒素的來源之一是當真菌毒素污染于動植物中,為了降低該毒素的毒害作用,受侵的動植物體會自發的發生脫毒反應而形成修飾型真菌毒素[12]。以植物解毒代謝為例,植物解毒過程分為三個階段。第一階段又稱轉化階段,該階段主要是發生還原、氧化、乙酰化和水解作用,生成對應的一級代謝產物(修飾型);第二階段又稱結合階段,在相關酶的作用下,將第一階段的產物或母體真菌毒素與極性較強的物質(如糖類[13]、硫酸鹽[14]和谷胱甘肽[15]等)相結合生成對應的二級代產物(修飾型);第三階段是將上述的代謝產物轉運、貯存或沉積于細胞器中(如液泡、細胞壁等),實現空間上的隔離。目前公認的修飾型真菌毒素分類見圖1[16]。真菌也能產生各種修飾型真菌毒素,如禾谷鐮刀菌,體外實驗發現該菌能誘導ZEN的合成且伴隨著大量I和Ⅱ級代謝產物[17]。此外,修飾型毒素另一來源是各種食品加工技術所產生的真菌毒素相關代謝物[18-19]。

實際上,研究表明有超過400種不同化學結構的真菌毒素,它們可由上述的途徑改性生成大量不同結構的修飾型真菌毒素[20]。單端孢霉烯族毒素、伏馬毒素B(fumonisin B,FB)、ZEN和OTA的修飾型已被發現并鑒定,其分子結構式見圖2[12,21-23]。目前在食品中發現的修飾型真菌毒素主要包括如下:

B型單端孢霉烯族毒素的修飾型,如DON的葡糖化產物(DON-3-葡萄糖苷(DON-3-glucoside,DON-3G)和DON-15-葡萄糖苷(DON-15G))[24]、雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol,NIV)的葡糖化產物(NIV-葡萄糖苷(NIV-G))、鐮刀菌酮X(fusarenone X,FUX)的葡糖化產物FUX-葡萄糖苷(FUX-G)[25]、DON的乙酰化產物(3-乙酰基-DON(3-acetyl-DON,3A-DON)和15-乙酰基-DON(15A-DON)[24]、DON的硫酸鹽產物DON-3-硫酸鹽(DON-3S)和DON-15-硫酸鹽(DON-15S)[14]、去環氧-DON(Deepoxy-DON,DOM)[26]等。

ZEN的修飾型,如ZEN-4-葡萄糖苷(ZEN-4G)、ZEN-4-硫酸鹽(ZEN-4S)、α/β玉米赤酶烯醇(α/β-zearalenol,α/β-ZEL)、α/β-ZEL-葡萄糖苷(α/β-ZELG)等[24]。

A型單端孢霉烯族毒素的修飾型,如T-2-葡萄糖苷(T-2G)和HT-2-葡萄糖苷(HT-2G)[21]、3-乙酰基-T-2(3A-T-2)和3-乙酰基-HT-2(3A-HT-2)[27]等。

FB的修飾型,如水解FB1/FB2/FB3(hydrolyzed FB1/FB2/FB3,HFB1/HFB2/HFB3)、N-羧甲基FB1(N-carboxymethyl FB1,NCM-FB1)、N-脫氧果糖基FB1(N-deoxyfructosyl FB1,NDF-FB1)等[22]。

OTA的修飾型,如14R-OTA、14-脫羧酶-OTA、OTA-甲基-α-二氯吡喃酯、OTA-葡萄糖酯、OTA-纖維二糖酯等[23]。

圖2 食品中常見的修飾型真菌毒素的化學結構Fig.2 Chemical structures of the most frequently occurring modified mycotoxins in food注:a:B型單端孢霉烯族毒素的修飾型;b:玉米赤霉烯酮類毒素的修飾型; c:A型單端孢霉烯族毒素的修飾型;d:水解伏馬毒素;e:赭曲霉毒素A的修飾型。

2 修飾型真菌毒素的毒性

目前對修飾型真菌毒素的毒理學性質存在爭議和不確定性。從脫毒方面來看,一般認為,修飾型真菌毒素的毒性比原型小,相關的報道也被證實。如在鐮刀菌污染的小麥中檢測到了植物的自然脫毒產物DON-硫酸酯,其毒性比原型小[14]。相似地結論也表明DON3G毒性偏低[28]。而且Lemmens等[29]發現DON能被葡萄糖糖基轉化酶催化生成DON-3G,同時也發現能將DON快速生成DON-3G能力的小麥品種通常對鐮刀菌有較高的抵抗性。另外,研究者通過烘烤和加熱處理制得的面包及其他谷物制品中發現了DON的異構化代謝產物iso-DON和nor-DON,其毒性比原型DON低[30]。但與之相反的結論也被相繼報道。對于DON毒素代謝物,Broekaert等[31]報道DON及其修飾型毒素72 h暴露后的腸道上皮細胞毒性如下:DON3G?3A-DON

從修飾型真菌毒素的降解方面而言,大量研究稱在人和動物體內修飾型真菌毒素能水解還原成原型真菌毒素。在體外模擬實驗中,Dall’Erta等[33]首次證實了DON-3G、ZEN-4G和ZEN-4S可被人體消化道中腸道菌水解成原型及其他代謝產物(如DOM-1)。ZEN14G和ZEN16G也能在人體胃腸細胞內發生脫糖基化反應后生成母體毒素,增加總雌激素的負荷,且ZEN14G比ZEN16G更易水解,其原因可能是人體的細胞溶質β-葡萄糖苷酶能裂解ZEN14G而無法裂解ZEN16G[34]。此外,人體和乳豬的喂食活體實驗中也發現了DON3G能在體內消化系統中可快速水解成DON原型及其他代謝產物DOM-1和DON-葡萄糖醛酸[7,35]。所以,修飾型毒素可能具有直接的毒理學性質,實際上真實的毒素暴露水平會遠大于目前檢測的量,故有必要將修飾型真菌毒素納入風險評估研究中。FAO/WHO食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)將DON-3G、3A-DON和15A-DON認定為人體DON膳食暴露[36]。2016～2018年,歐洲食品安全局(EFSA)也相繼對ZEN[37]、DON[38]、NIV[39]、T-2、HT-2[40]和FB[41]及相關修飾型毒素的膳食暴露情況開展了相關風險評估工作。

3 食品中修飾型真菌毒素的同時檢測

食品中修飾型真菌毒素的檢測過程一般包括取樣、均質、提取、凈化、檢測和定量[1]。由于毒素的不同理化性質和食品基質的多樣性等,目前已發展出不同的提取方法、凈化方式和檢測技術。

3.1 提取方法

固-液體提取法(solid-liquid extraction,SLE)是使用溶劑的最傳統且最常用的食品樣品前處理技術之一。對極性較強的修飾型真菌毒素而言,常用的提取試劑為乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯等有機溶劑。目前,有機溶劑與一定比例水或酸性緩沖溶液的混合提取液被大量應用于修飾型真菌毒素的提取。水的加入可以充分浸潤樣品,促進有機溶劑對樣品的滲透能力,尤其對易發生交聯反應的高淀粉、高蛋白樣品,如谷物及其制品等。乙腈和水(84∶16,v/v)[42]、甲醇和水(70∶30,v/v)[43]已用于提取谷物及其制品中多種毒素。pH對毒素的提取效率有影響[44]。一般加入適量的酸性溶液(乙酸或甲酸等)可以提高其回收率。如加入1%的乙酸可有效提取紅葡萄酒包括DON、ZEN及其隱蔽型在內的36種毒素,回收率可高達120%[45]。FBs毒素屬酸性毒素,提取試劑為含0.1%甲酸的乙腈/水(99∶1,v/v)可使回收率提升至80%[46]。而對于脂肪含量較高的食品,推薦使用非極性溶劑如己烷和環己烷脫脂后再經乙腈/水/乙酸(79∶20∶1,v/v/v)進行提取[24]。另一方面,研究者也能通過間接法提取出食品基質中的總毒素(母體和修飾型毒素)。Brya等[47]用氫氧化鉀堿水解玉米制品中的修飾型毒素后,再用二氯甲烷提取其中的總FBs毒素(母體和修飾型毒素)。

近年來,許多儀器自動溶劑提取方法在真菌毒素及修飾型毒素的分析中得到應用。一般包括超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction,SFE)、加速溶劑萃取和微波輔助提取等。與傳統方法相比,這些方法安全環保,效率高,但成本更高[1]。如Zougagh等[48]應用SFE法對玉米粉中ZEN、α/β-ZEL毒素進行提取。

3.2 凈化方式

為了更好的檢出目標物,避免蛋白質、脂類、有機酸、酚類和色素等基質干擾成分的影響,通常會進行凈化處理。目前,多功能凈化柱、固相萃取柱、免疫親和柱和凝膠滲透色譜凈化法在多種毒素凈化環節上的研究較多。Sun等[46]曾對比了多功能凈化柱、吸附粉和固相萃取柱對25種真菌毒素及其修飾型真菌毒素的凈化效果,結果顯示C18和氨基固相萃取柱更適用于多種毒素的同時凈化,但氨基柱不適用弱極性FBs和OTA兩種毒素的凈化。DON免疫親和柱對DON及其修飾型毒素(DON3G、15A-DON和3A-DON)有良好的交叉性,能有效評估樣品中DON的總含量(原型及修飾型)[49]。宮小明等[50]利用凝膠滲透色譜凈化法(層析柱:30 mm×210 mm,填料:Bio-Beads SX-3填料,流動相:乙酸乙酯/環己烷)成功凈化花生和玉米油中DON、3A-DON、15A-DON等18種真菌毒素,回收率達到80%～96%。

此外,QuEChERS技術是快速、簡單、便宜、有效、可靠、安全的前處理技術,已被大量應用于谷物及其制品[51]、堅果[52]、啤酒[53]和芝麻醬[54]等不同食品基質中多種毒素的同時提取和凈化。QuEChERS技術的提取凈化效果受樣品基質、提取劑、鹽析劑、凈化劑等多個因素的影響[55]。C18是常使用的凈化劑,它通過非極性相互作用可以有效去除糖類和脂類物質。但C18固相萃取柱對啤酒的凈化效果優于花生等含脂高的食品[52-53]。不同凈化劑可以組合使用。C18和乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine,PSA)有效吸附綠茶中的有機酸、酚類和脂類[44]。與C18和Z-Sep+結合吸附劑相比,增強型脫脂吸附劑對堅果食品凈化后基質效應更小,大多毒素基質效應小于±20%[52,56]。總之,凈化方式的選擇和使用可根據具體食品基質的特點和目標毒素的結構性質。但實際上目前的凈化方法很難完全去除干擾物,基質效應仍然存在,可能對方法的靈敏度和選擇性有一定的影響。

3.3 檢測技術

修飾型真菌毒素一般無法用常規檢測技術檢出,人們易低估其風險和暴露水平。所以,建立一套能實現對其準確發現和定性的檢測技術非常重要。如今研究者已成功報道了修飾型真菌毒素同時檢測的方法,其主要包括液相色譜-串聯質譜法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和酶聯免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。

3.3.1 液相色譜-串聯質譜法 LC-MS是最常見的分析多種真菌毒素及其修飾型毒素的檢測方法。質譜儀根據檢測器不同工作原理可分為三重四級桿-串聯質譜儀(triple quadruole-mass spectrometry,QqQ-MS)、離子阱質譜儀(iron trap-mass spectrometry,IT-MS)、飛行時間質譜儀(time of flight-mass spectrometry,TOF-MS)和靜電場軌道阱質譜儀(Orbitrap-mass spectrometry,Orbitrap-MS)。表1匯總了LC-MS同時檢測不同食品基質中多種毒素的情況。

表1 液相色譜串聯質譜法同時檢測不同食品基質中原型及修飾型真菌毒素Table 1 Simultaneous determination of mycotoxins and their modified metabolites in different food matrices by liquid chromatography-tandem mass spectrometry

注:-代表該值文獻中未提供。

QqQ-MS是日常真菌毒素檢測工作法定的標準方法[57],電噴霧正離子多反應監測模式(multiple reaction monitoring,MRM)能實現同步定量和定性,靈敏度高、選擇性強,目前應用較多。Blesa等[58]利用LC-QqQ-MS/MS檢測了80個小麥樣品中包括DON、3A-DON和15A-DON等在內的18種毒素,所有分析物在20 min內均有良好的色譜分離,定量限為1.0～250 μg/kg。Yang等[59]建立了UPLC-MS/MS快速測定雞肉、豬肉、雞肝和豬肝中單端霉烯族毒素及其主要代謝產物的分析方法。加標樣品的平均回收率為74%～97%,方法的檢測限和定量限分別為3.0～15.0和10.0～50.0 μg/kg。UPLC-MS/MS適用于紅葡萄酒中36種真菌毒素和200種殺蟲劑的檢測,其中35種毒素的回收率為70%～120%[45]。

IT-MS是另一常見的低分辨儀器,因其特有的空間限定特點,能實現多級質譜分析,具有很強的物質結構鑒定能力。QqQ-MS與IT-MS復合質譜系統可提高檢測靈敏度,因此LC-QTrap-MS/MS技術的使用較為常見。LC-QTrap-MS/MS適用于DON和ZEN原型及相關修飾型毒素的鑒定和檢測。小麥中發現兩種DON新型代謝產物DON-3S和DON-15S,該方法DON-3S和DON-15S檢出限可達到0.003和0.002 mg/kg[14]。它也適用于伏馬毒素類修飾型毒素的檢測。如Dall’Asta等[43]使用LC-QTrap-MS/MS方法在無麩質食品中均檢測到HFBs(HFB1、HFB2和HFB3),其中零食食品中檢出的HFBs中位值高達1430 μg/kg。

但是上述兩種MS屬低分辨率,通常僅適用少量目標化合物的分析。而且標準品的缺乏制約了大量修飾型真菌毒素的定量和檢測。為了減小食品基質效應,一般通過同位素標記內標法或基質匹配標準曲線解決,不過目前商業化的產品主要集中于DON、T-2和HT-2的修飾型毒素。

近年來,全掃描技術的發展彌補了低分辨質譜技術的劣勢。高分辨質譜(high resolution mass spectrometers,HRMS),如TOF-MS和Orbitrap-MS利用全掃描模式獲得高靈敏度,高分辨率(可達100000 FWHM),高質量數精確度(<5 ppm)。與QqQ方法相比,LC-HRMS串聯法能進行目標分析、未知組分鑒定和數據分析溯源等[60]。LC-HRMS已被成為食品中多組分分析的利器[61]，已大量應用于DON[62-63]和FUX[25]的修飾型毒素、ZEN的硫酸鹽[64]、H-2/HT-2的糖苷物[65]、FBs的水解產物[47]、OTA的多糖酯類[23]。同時,HRMS仍存在基質效應,導致離子抑制或增強現象。不過,即使存在離子抑制現象,研究者也聲稱HRMS能通過寬的儀器動態范圍對不同理化性質的55種真菌毒素、323種農藥和11種植物毒素進行高選擇性和高靈敏性的檢測[66]。此外,與Orbitrap/MS相比,TOF/MS更容易受到復雜基質啤酒的干擾[67]。在實際應用過程中,人們常將HRMS質譜與其他質量分析器質譜聯用。HRMS與QqQ-MS結合能提高檢測準確性和靈敏度。LC-Q-TOF/MS可快速篩查和確證小麥、玉米中13種毒素[68];UPLC-Q-Orbitrap-HRMS被應用于谷物[69]、奶制品[26]和大豆食品[70]。另外,TOF-MS與IT-MS質譜聯用時,可實現多級碎裂精確分析,提高真菌毒素結構分析能力。如研究者利用LC-IT-TOF/MS方法發現了T-2、HT-2、DON、3A-DON和雪腐鐮刀菌醇(NIV)5種毒素的裂解規律。T-2和HT-2毒素使用[M+Na]+裂解模式,脫去異戊酰基和乙酸基是其常見的裂解途徑,而DON、3A-DON和NIV使用[M-H]-模式,環氧裂解是三者的常見裂解途徑[71]。最后,TOF-MS與Orbitrap-MS結合能進一步實現高通量分析,它已被應用于食品中3A-DON等200多種真菌毒素及代謝物的檢測[72]。

不過,高分辨質譜在某些方面仍需提升。同量異位物的分離和鑒定存在難度,為了提高未知分子鑒定能力,離子遷移光譜法被推薦使用[73]。HRMS靈敏度低于QqQ法,檢出限偏高,少量樣品能被HRMS定量。此外,樣品經HRMS方法檢測易出現較大未知的雜峰,檢測結果可能出現假陽性或假陰性。Kluger等[62]經C13標記內標法以鑒定小麥中各種新的未知脫毒產物。

3.3.2 酶聯免疫法 研究者也采用ELISA法來檢測修飾型毒素。相比LC-MS法,該法具有快速、易操作性、高特異性、高靈敏度和低成本等優勢,更適宜大量樣品中修飾型毒素的快速定性篩查和現場檢測。Usleber等[74]通過免疫兔子獲得DON和3A-DON的抗體,并利用50%的抑制水平測定其交叉反應性。結果發現,DON抗體與3A-DON(100.0)和15A-DON(1.1)有較強的交叉反應性(相對于DON=1.0),與NIV(0.063)和FUX(0.016)的交叉反應性較小;3A-DON抗體對3A-DON具有明顯的特異性(3A-DON=1.0),與15A-DON(0.016)和DON(<0.001)僅有輕微的交叉反應。在DON抗體基礎上,建立的直接ELISA檢測DON,3-A-DON和15-A-DON的檢出限分別為1.0、0.05和1.5 μg/mL;在3A-DON抗體基礎上,建立的直接ELISA法測定的3A-DON檢出限為0.1 μg/mL。但是,研究也指出制備的DON抗體一般會對3A-DON和15A-DON有不同程度的交叉反應,使得檢測的DON含量高于實際真實含量[75]。

綜上所述,因潛在的交叉反應,使得ELISA法測得的結果可能是母體毒素及多種修飾型毒素的總含量。因此ELISA法更適用毒素風險的快速篩查,對陽性結果則需通過其他方法(如LC-MS/MS)進行驗證。

4 結論與展望

近年來,修飾型真菌毒素的“隱蔽性”愈發吸引研究者的關注和探究。目前食品中主要發現了五大類真菌毒素的相關修飾型毒素,其中單端孢霉烯族毒素和ZEN毒素在毒性和同時檢測方面研究最多,而經葡糖化、酰基化和硫酸鹽作用產生修飾型毒素的研究最為明晰。不過,國內外對修飾型真菌毒素的認識不足,部分修飾型真菌毒素,甚至國內外都缺乏檢測方法。而且由于其數量多、結構多樣且商業化標準品缺乏等導致檢測技術有待提升。另外,大多修飾型毒素毒性研究偏少,如T-2和HT-2的糖苷類產物是否在動物體內存在降解代謝仍存疑。從食品中毒素污染情況來看,目前仍集中于谷物及其制品中,對豆類等農產品研究不多。而且對于加工類食品,其加工工藝的不同是否會影響修飾型毒素的產生或產生的組分種類和含量是否存在差異還未可知。綜上,修飾型毒素已廣泛存在于食品中,對人和動物的健康存在潛在的安全風險。研究者已在修飾型毒素的來源、污染情況、毒理學性質和檢測方法等方面取得了一定的成果,但是仍存在很多的挑戰。不過,相信經過研究者的努力,人們可以更合理地評估隱蔽型真菌毒素的風險及對該類毒素采取調控措施。