miR-124在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后關(guān)系研究*

蘇建淳，張國義，盧秋霞，全 強(qiáng)

廣東省佛山市第一人民醫(yī)院鼻咽放療二科(佛山528000)

最新發(fā)布的2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，鼻咽癌占所有惡性腫瘤的0.7%,以性別分層,男性中鼻咽癌新發(fā)病例占新發(fā)癌癥的2.2%[1]。盡管放療、化療等治療技術(shù)不斷進(jìn)步，鼻咽癌取得了不錯(cuò)的療效，但鼻咽癌易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā),仍有19%～56% 的患者在放療后 5 年內(nèi)復(fù)發(fā),尤其是晚期鼻咽癌患者[2-3]。目前對(duì)鼻咽癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍缺乏有效低毒的治療手段，研究其進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，探索新的治療模式，成為近年來研究的重點(diǎn)之一[4]。微小RNA(microRNA,miRNA) 是一類內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA，它能夠與靶基因的mRNA的3’Um端結(jié)合進(jìn)而降解mRNA或抑制翻譯過程。已有多種miRNA被發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中存在異常性表達(dá)[5]。miR-124已被證實(shí)在多種腫瘤中發(fā)揮作用，也有研究顯示其能抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖，但在鼻咽癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后方面相關(guān)報(bào)道不多。為進(jìn)一步探討miR-124在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測(cè)62例鼻咽癌組織miR-124表達(dá)情況，探討其表達(dá)強(qiáng)度與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

1 一般資料 收集 2014年1月至2015年9月在我院診治的鼻咽癌患者62例，其中53例無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，9例伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;男性45例，女性17例，平均年齡(47.58±12.45)歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：治療前進(jìn)行活檢確診為鼻咽癌，確診后均予放化療治療，未患其他癌癥或嚴(yán)重的心、肝、腎、腦等病變，非孕婦，相互無血緣關(guān)系,均為漢族。為確定局部復(fù)發(fā)情況及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移范圍，所有患者均常規(guī)行MRI等相關(guān)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者存在有放化療相關(guān)禁忌證；既往患有其他腫瘤病史；接受過任何免疫治療、分子治療等抗腫瘤治療。選取同期62例慢性鼻咽炎患者為對(duì)照組，按照性別、年齡進(jìn)行匹配。所有標(biāo)本均為治療前活檢標(biāo)本，儲(chǔ)存于-80℃待用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

2 隨 訪 對(duì)62例患者進(jìn)行隨訪，了解遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)間、死亡時(shí)間及原因。發(fā)現(xiàn)死亡或轉(zhuǎn)移隨訪即終結(jié)。隨訪時(shí)間從第一次明確診斷開始，到發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)間或死亡時(shí)間或末次隨訪時(shí)間，截止到2018年9月30日。無瘤生存期(DFS) 時(shí)間從初次治療開始至發(fā)生轉(zhuǎn)移或死亡時(shí)為止。

3 材料與主要試劑 人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1(美國 ATCC 公司)，GAPDH 抗體(美國 Abcam公司)，IgG二抗(上海碧云天公司)，miR-124 siRNA、NC siRNA(蘇州吉瑪制藥公司)，Lipofectamine-2000、RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Invitrogen公司)；RNA 提取試劑 Trizol (美國 Life 公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒(TaKaRa 公司)，miR-124逆轉(zhuǎn)錄引物(廣州銳博公司)；CCK-8 試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所),Invasion和Migration試劑盒(美國Millipore公司)。

4 RT-qPCR方法 提取組織中總RNA，采用RT-qPCR方法檢測(cè)標(biāo)本中miR-124 的表達(dá)水平，以及與分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等臨床資料之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒及文獻(xiàn)方法操作。RT-qPCR 條件：95℃ 1 min；95℃15 s、60℃ 20 s，循環(huán)40次；取U6作為內(nèi)參照。結(jié)果采用2-ΔΔCt方法對(duì)miR-124在癌組織及對(duì)照組標(biāo)本中的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析。

5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將CNE-1在10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為 37℃，CO2濃度為5%。將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第3代，以70%～80%的密度接種于培養(yǎng)基中。根據(jù)說明書，使用Lipofectamine-2000將miR-124 siRNA轉(zhuǎn)染至CNE-1細(xì)胞，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

6 CCK-8細(xì)胞增殖活性測(cè)定 將指數(shù)生長的CNE-1細(xì)胞(5×105細(xì)胞/ml)接種到96孔板，培養(yǎng)72 h，加入CCK-8溶液(10 μl /ml)，37℃、5% CO2條件下孵育4 h。使用酶標(biāo)儀板在490 nm波長下測(cè)量細(xì)胞在24、48、72 h的OD值，細(xì)胞活力(% ) =[OD(miR-124 siRNA)-OD(空白)]/[OD(NC siRNA)-OD(空白)]×100%。

7 Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) 將200 ml的培養(yǎng)基(1×104個(gè)細(xì)胞)接種到每個(gè)Transwell中，并在37℃下孵育24 h，去除留在腔室上表面的細(xì)胞，而膜的下表面用4%多聚甲醛固定 20 min，0.5%結(jié)晶紫溶液染色5 min，洗滌后，使用Image-Pro Plus6.0軟件測(cè)定不同組中的細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn):40 ml Matrigel基質(zhì)膠 4℃下過夜融化，并與3體積的無血清培養(yǎng)基混合均勻后加入24 孔Transwell小室(每孔50 μl)，其余實(shí)驗(yàn)步驟及方法參照實(shí)驗(yàn)說明書。

結(jié) 果

1 臨床病理特征 62例鼻咽癌患者，其中初治時(shí)53例無轉(zhuǎn)移、9例初治時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期共9例、Ⅲ期14例、Ⅳa期30例、Ⅳb期9例，其中Ⅰ期、Ⅱ期為早期，Ⅲ期為中期，Ⅳa期為局部晚期，Ⅳb期為晚期。隨訪結(jié)果顯示3例失訪，59例隨訪患者隨訪時(shí)間4～57個(gè)月，出現(xiàn)死亡或轉(zhuǎn)移隨訪即終結(jié)；其中死亡5例，轉(zhuǎn)移7例，47例無瘤生存。DFS≥3年的41例，DFS<3年的18例。

2 鼻咽癌組織中miR-124的表達(dá)水平 RT-qPCR結(jié)果顯示，鼻咽癌組組織中miR-124的表達(dá)量為(1.49±0.39)，對(duì)照組組織中miR-124的表達(dá)量為(2.12±0.43)。統(tǒng)計(jì)分析提示，鼻咽癌組織中miR-124的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.545，P<0.01)。見圖1。

與對(duì)照組比較，*P<0.01

3 miR-124的表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征之間的關(guān)系 分析miR-124表達(dá)量與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果顯示，miR-124的表達(dá)強(qiáng)度與性別、年齡無關(guān)(P>0.05) ，初治時(shí)轉(zhuǎn)移組miR-124表達(dá)量顯著低于無轉(zhuǎn)移組(P<0.05) ；TNM分期中，Ⅲ-Ⅳ期晚期患者癌組織中miR-124 的表達(dá)顯著低于Ⅰ-Ⅱ期早期患者。見表 1。

表1miR-124的表達(dá)與62例鼻咽癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

4 miR-124的表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系 以有效隨訪的鼻咽癌患者無瘤生存期(DFS) 時(shí)間作為預(yù)后情況指標(biāo)。有效隨訪的59例中，DFS≥3年41例，DFS<3年18例。DFS≥3年組miR-124表達(dá)量(1.83±0.49)明顯高于DFS<3年組miR-124的表達(dá)量(1.18±0.34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.103,P<0.01)。見圖2。

與DFS<3年組比較，*P<0.01

5 miR-124過表達(dá)對(duì)人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞系增殖、遷移、侵襲的影響 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-124 siRNA顯著提高miR-124在人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中的表達(dá)水平(圖 3A)。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-124 siRNA與轉(zhuǎn)染NC-siRNA相比，在24、48、72 h 這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，CNE-1細(xì)胞增殖數(shù)目明顯減少，說明miR-124 siRNA能夠顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖(圖3B)。Transwell 實(shí)驗(yàn)表明CNE-1細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目明顯低于轉(zhuǎn)染NC-siRNA組(圖3C)，提示轉(zhuǎn)染miR-124 siRNA能夠顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲及遷移。

圖3 miR-124過表達(dá)對(duì)人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞系增殖、遷移、侵襲的影響

討 論

鼻咽癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜過程，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌死亡的首要原因。但目前鼻咽癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未明確，缺乏指示鼻咽癌早期復(fù)發(fā)的分子生物學(xué)標(biāo)志物。深入研究鼻咽癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制尤其是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找預(yù)測(cè)分子標(biāo)記物，對(duì)鼻咽癌的臨床治療有重要意義。殷亞磊等[6]研究發(fā)現(xiàn)LASS2蛋白表達(dá)與鼻咽癌復(fù)發(fā)負(fù)相關(guān)，LASS2陰性患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更大。張璐等[7]發(fā)現(xiàn)EBV病毒、NLR、VCA-IgA、同步放化療等與鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。還有研究[8]發(fā)現(xiàn)miR-3182可能促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。miRs作為新的致癌或抑癌基因與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[9]，如前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等。近年來，miR-124被發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)，包括肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、腎癌、乳腺癌等多種腫瘤。

本研究中鼻咽癌組織中miR-124的表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-124低表達(dá)能夠促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展，與田允鴻等[10]、許珊等[11]的體外實(shí)驗(yàn)中結(jié)果一致。miR-124在鼻咽癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度與性別、年齡無關(guān)，但與是否轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)。研究結(jié)果顯示,TNM分期中,Ⅲ-Ⅳ期晚期患者癌組織中miR-124 的表達(dá)顯著低于Ⅰ-Ⅱ期早期患者，說明TNM分期越晚，miR-124的表達(dá)越低；初治時(shí)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的miR-124表達(dá)量顯著低于無轉(zhuǎn)移組，提示miR-124的低表達(dá)在鼻咽癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。對(duì)59例鼻咽癌患者的隨訪發(fā)現(xiàn)，無瘤生存期(DFS)≥3年者miR-124表達(dá)量明顯高于DFS<3年者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-124表達(dá)越高，患者預(yù)后越好。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)染miR-124 siRNA可顯著提高miR-124在人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞表達(dá)水平，能夠顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。通過以上結(jié)果，我們推測(cè)miR-124抑制鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，進(jìn)而抑制鼻咽癌的生長、發(fā)展及轉(zhuǎn)移；miR-124可能通過干擾腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。當(dāng)然，本研究由于樣本量受限，這一結(jié)果還需要在大樣本研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。下一步，我們將對(duì)miR-124在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的信號(hào)通路及調(diào)控的靶基因進(jìn)行深入研究。

總之，我們研究證實(shí)了miR-124在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可預(yù)測(cè)鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。miR-124抑制鼻咽癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和對(duì)預(yù)后影響的作用機(jī)制及其在探索新的治療方法中的價(jià)值有待進(jìn)一步研究。今后，我們將對(duì)鼻咽癌發(fā)展過程中miR-124的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。