親環素A及腦梗死相關血液指標與頸動脈粥樣硬化斑塊形成和穩定性及腦梗死的相關性研究

趙悅杉， 郭若一， 顧天舒， 王世佳， 于 萍， 郭 力， 李 彬

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是臨床中最常見引起腦卒中的病因，有研究表明不穩定斑塊不可預測地脫落和破裂是缺血性腦卒中的獨立危險因素[1，2]。

研究表明，動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展與氧化應激、炎癥因子造成的炎細胞浸潤、內皮損傷等密切相關[3]。其中CyPA作為一個近年來新型的炎癥標志物，被證明與斑塊的不穩定性相關[4]。CyPA是一種具有多種生物學功能的蛋白，為免疫抑制劑環孢素A(cyclosporin A，CsA)的作用靶點，近些年又因其與動脈粥樣硬化的密切關系而被關注。CyPA作為過度氧化應激的產物，是炎癥瀑布較為上游的因子，其通過導致內皮細胞損傷、趨化炎癥細胞加重局部炎癥反應、CyPA-CD147-MMP(NF-κB)等途徑參與斑塊的形成且與斑塊穩定性相關。國內外的動物試驗均提示CyPA與動脈粥樣硬化斑塊的穩定性相關，但目前尚缺少臨床實驗證實此點。

臨床中常見的血液指標，如總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、糖化血紅蛋白、纖維蛋白等在國內外文獻中與動脈粥樣硬化斑塊的關系呈現出不一致性，在本文中進行進一步研究探討。

彩色多普勒超聲是臨床中發現、評估頸動脈粥樣硬化斑塊的常用手段，但由于頸動脈斑塊的穩定性并沒有明確的標準的判定方法，所以各研究對于彩色多普勒下動脈斑塊穩定性所用的判斷方法不一，多數簡單以超聲下斑塊的密度、大小作出人為判斷，本文將以頸動脈多普勒下動脈斑塊的形態、密度、長度、厚度等嚴格分級做出客觀評分來評價斑塊的穩定性，從而進一步探討頸動脈斑塊穩定性與缺血性卒中發生的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2017年12月～2018年12月期間于河北醫科大學第二醫院神經內科的住院治療的急性腦梗死且存在與腦梗死部位位于同側的頸動脈斑塊的患者56例為腦梗死組，無急性腦梗死但存在頸動脈斑塊的人72例為斑塊組，未發現動脈粥樣硬化斑塊的且無急性腦梗死的健康體檢者40例為無斑塊組。腦梗死組還要求符合以下納入標準：所有腦梗死患者均符合2012年缺血性腦卒中診斷和診療質量控制行業標準，且發病時間不超過3 d；腦梗死類型符合TOAST分型中的 LAA 型；急性梗死灶位于前循環供血區且與頸動脈斑塊位于同側；急性梗死灶及頸動脈斑塊的對應側無嚴重顱內動脈狹窄。各組排除標準：(1)急性冠狀動脈綜合征、心力衰竭、各種嚴重的先天性心臟病；(2)自身免疫性疾病及其它炎癥性疾病；(3)惡性腫瘤、合并嚴重肝腎功能損害等疾病；(4)6 m內既往腦血管病病史；(5)合并腦出血、腦血管畸形、顱內靜脈竇血栓等顱腦疾病者；(6)患各類急慢性感染性疾病；所有入選患者及健康體檢者均由其本人或監護者簽署知情同意書，并提供血樣，過程符合醫學倫理及人道主義要求。

1.2 方法

1.2.1 血液指標測定 住院患者于入院次日晨抽取空腹靜脈血標本，健康對照者于體檢當日抽取空腹靜脈血標本，所得標本一部分進行血常規、生化全項及凝血常規檢查，另一部分放入促凝管內，充分混合均勻，于標本采集30 min內在2～8 ℃環境下以3000 r/min離心15 min，留取血清，-80 ℃ 保存備用。應用ELISA測定CyPA值(試劑盒來自上海江萊生物有限公司)，嚴格按照說明說進行操作。

1.2.2 頸動脈超聲檢查

1.2.2.1 檢查方法及圖像數據處理 采用西門子ACUSON超聲儀，探頭中心頻率為10 MHz。

1.2.2.2 超聲結果的判讀及斑塊評分 頸動脈斑塊診斷標準：檢測雙側頸總動脈、頸內動脈，并于頸動脈分叉處近心端1 cm處后壁放大后測量頸總動脈內膜-中層厚度(Intima-media Thickness，IMT)，IMT>1.5 mm定義為斑塊形成[5]。

斑塊的測量：橫斷面、縱斷面綜合判斷，觀測記錄斑塊的數量，長度和厚度，多角度觀察斑塊的質地和形狀。

斑塊評分：斑塊的均質性(回聲一致性)：均質斑塊記0分，不均質斑塊記1分；斑塊的厚度 厚度小于2 mm記0分，厚度在2～3 mm之間記1分，厚度大于3 mm記2分；斑塊的長度小于15 mm記0分，大于15 mm記1分；若斑塊造成了管腔狹窄，狹窄程度50%～69%記3分，70%～99%及4分(與斑塊厚度不重復記分)；斑塊的形態：斑塊表面纖維帽中斷、斑塊表面可看見血栓形成，斑塊表面存在較大凹陷記3分。形態規則記0分。最終取同側頸總動脈、頸內動脈的所有可測量斑塊記分之和為最終單側頸動脈斑塊的評分。腦梗死組記錄與急性梗死灶對應側的頸動脈評分，斑塊組記錄雙側頸動脈評分[6，7]。

2 結 果

2.1 三組基礎資料比較 經比較，三組之間在性別、年齡、冠心病、飲酒方面無統計學差異(P>0.05)，但在高血壓、糖尿病、吸煙史方面有統計學差異(P<0.05)(見表1)。

2.2 無斑塊組與斑塊組CyPA和相關血液指標的比較 斑塊組CyPA明顯高于無斑塊組，且兩組之間的差異有統計學意義(P=0.012)，說明CyPA與斑塊的形成相關。Logistic回歸表明CyPA是頸動脈斑塊形成的危險因素(OR=1.002，95%CI0.824～1.219)。其余指標兩組之間均無統計學差異(見表2)。

2.3 腦梗死組與斑塊組斑塊評分的比較 將腦梗死組的病灶對應側的頸內、頸總動脈的斑塊評分與斑塊組雙側頸內動脈及頸總動脈的斑塊評分進行比較。結果發現腦梗死組的斑塊評分顯著高于斑塊組的斑塊評分，且兩組之間差異有統計學意義(P=0.005)，兩組的斑塊評分均值分別為(2.94±3.63)、(0.95±1.32)。說明頸動脈斑塊的不穩定性與腦梗死的發生密切相關(見表3)。

2.4 腦梗死組內CyPA及相關血液指標與頸動脈斑塊評分的比較 收集腦梗死病灶同側頸內動脈、頸總動脈的斑塊評分，與CyPA及相關血液指標進行比較。其中糖化血紅蛋白(P=0.019，相關系數為0.359)、纖維蛋白原(P=0.041，相關系數為0.296)、血紅蛋白(P=0.033，相關系數為-0.289)與頸動脈斑塊評分之間存在相關性。經Logistics回歸后，纖維蛋白原是動脈粥樣硬化斑塊發展的獨立危險因素(OR=8.988，95%CI3.017～3.422)。血紅蛋白是動脈粥樣硬化斑塊發展的保護因素(OR=0.936，95%CI134.031～144.583)。余指標與頸動脈斑塊評分之間未發現明顯相關性(P>0.05)(見表4)。

2.5 斑塊組內CyPA及相關血液指標與頸動脈斑塊評分的比較 將斑塊組患者雙側頸內動脈、頸總動脈斑塊的斑塊總分與血CyPA及相關血液指標進行統計學分析。其中高密度脂蛋白與斑塊總分存在相關性(P=0.014，相關系數為-0.300)，經Logistic回歸分析后，高密度脂蛋白是動脈粥樣硬化斑塊發展的保護因素(OR=0.052，95%CI1.237～1.364)。余指標與斑塊評分之間的比較均未發現明顯相關性(見表5)。

表1 3組之間基礎臨床資料的比較[n(%)]

注：兩組間差異有統計學意義P<0.05

表2 斑塊組與無斑塊組CyPA與相關血液指標的比較

注：兩組間差異有統計學意義P<0.05

表3 腦梗死組與斑塊組頸動脈斑塊評分比較

注：兩組間差異有統計學意義P<0.05

表4 腦梗死組內頸動脈斑塊評分與CyPA及相關血液指標比較

注：兩組間差異有統計學意義P<0.05

表5 斑塊組內頸動脈斑塊評分與CyPA及相關血液指標比較

注：兩組間差異有統計學意義P<0.05

3 討 論

國內外普遍認為動脈粥樣硬化是一種炎性疾病，是多種炎癥因子的作用下血管內皮的一種慢性炎癥[8～10]，它是各種氧化應激因素如高血壓、高血糖、高血脂等的復雜作用的結果。

本實驗意在探究在健康人群(無腦梗死)中和腦梗死人群中CyPA與頸動脈斑塊的形成和穩定性的關系。關于為何將腦梗死人群和非腦梗死人群分開研究，是由于腦梗死本身存在的局部炎癥反應會影響CyPA等炎性因子的含量。本文通過無斑塊組(無斑塊、無梗死)與斑塊組(無腦梗死，僅有斑塊)的比較來反應CyPA與斑塊形成的關系，結果顯示兩組之間的CyPA水平有統計學差異，反應了CyPA與斑塊的形成相關，可能的機制為在各種氧化應激的刺激下，CyPA通過誘導內皮細胞損傷及凋亡導致內膜屏障受損，且趨化和聚集巨噬細胞等炎癥細胞在血管局部吞噬脂質，導致泡沫細胞形成。本文通過腦梗死組及斑塊組的組內斑塊評分的比較來探究CyPA與頸動脈斑塊穩定性的關系，結果表明無論是腦梗死組還是斑塊組CyPA與頸動脈斑塊評分無明確的相關性，對于此點與部分文獻的結果不一致，我們認為這一結果：(1)在斑塊組中患者均來自于體檢中心，總體來說斑塊的評分較低(普遍較為穩定)，大多數在3分以內，這樣情況下斑塊穩定性差異較小，可能CyPA的差異未顯現出來；(2)在腦梗死組中由于每個患者的梗死面積不同，局部產生的炎性因子也不同，可能對我們的測量帶來誤差；(3)與動物實驗不同，臨床試驗并不能將斑塊取出進行斑塊內檢測，我們檢測的因子均為血液循環中的因子，受全身斑塊的影響，我們只進行了頸動脈斑塊的評分，對于身體中其余斑塊并未評分，可能也成為了陰性結果的原因；(4)另外對于斑塊穩定性的評價方法，每個實驗不盡相同，大多數實驗判斷斑塊的穩定性主觀性較強，且只能針對單個斑塊來判斷，對于一根血管的整體狀態反應欠佳，而本實驗確定了一個相對客觀的評分，可以將每個斑塊評分相加來反應該血管的斑塊狀態，可能也是實驗結果不同的原因。

本文通過比較斑塊組和腦梗死組的斑塊評分來探究腦梗死與斑塊不穩定性之間的關系。為了使斑塊與腦梗死之間的關系更有說服力，在腦梗死組我們僅計算了與腦梗死病灶對應側的斑塊總評分，與非腦梗死的的雙側頸動脈評分總分進行比較，在此種情況下兩組的斑塊評分仍表現出了顯著的統計學差異，這也就表明了斑塊的不穩定性與腦梗死的發生密切相關，不穩定斑塊的脫落與破裂可能導致了腦梗死的發生，另外不穩定斑塊可以導致血小板的聚集導致局部官腔狹窄，從而造成血流動力學改變而引發腦梗死。

在腦梗死組中，我們發現糖化血紅蛋白與頸動脈斑塊評分之間存在明確的關系，與斑塊的穩定性成負相關(斑塊組由于數據缺失未分析)。高血糖是缺血性腦血管病尤其是腦梗死的危險因素這一點已經被絕大多數研究者認可，其大致機制為：(1)高濃度的血糖使機體氧化應激加強，此過程中產生大量的活性氧，促進脂氧化終末產物的生成及蓄積導致炎性因子如超敏C反應蛋白等的分泌及血管內皮的功能紊亂[11]；(2)糖尿病還會造成微血管、大血管病變，引起平滑肌細胞及纖維細胞增生、結構重塑，這些細胞攝取脂質的同時也造成內膜損傷而與斑塊形成有關。纖維蛋白原與斑塊的穩定性相關呈負相關(斑塊組由于數據缺失未分析)。現在較多研究表明[12]纖維蛋白原與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發生、發展等方面相關，免疫組化研究表明纖維蛋白原在穩定、不穩定斑塊中都是重要的組成成分，但在不穩定斑塊中的含量顯著增加[13]。有些臨床研究表明纖維蛋白原與斑塊的形態和進展相關，在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的患者中尤其是急性冠脈綜合征的患者中纖維蛋白原與冠狀動脈斑塊的斑塊負荷(包括斑塊面積、斑塊體積)等呈正相關。Corban MT[14]認為纖維蛋白原是斑塊內大脂質核心的獨立危險因素。本實驗提示這種關系可能同樣適用與頸動脈斑塊。纖維蛋白原可以激活幾條促炎通路，這些通路會導致內皮細胞[15]、血管平滑肌細胞[16]、單核巨噬細胞、中性粒細胞[17]功能障礙；另外，纖維蛋白原還可以通過增加血液黏稠度，刺激血小板的聚集[18，19]，通過細胞外信號調節激酶(ERK)-F肌動蛋白途徑損傷內皮細胞，導致內皮細胞的通透性增加，刺激血管平滑肌細胞的增殖和遷移等對動脈粥樣硬化的發生發展起作用。

腦梗死組的患者中血紅蛋白的含量與斑塊的穩定性呈正相關。對于此點，尚缺乏此類研究。血紅蛋白存在于紅細胞內，它的變化及原理應與HCT相似。有研究認為[20]紅細胞比容：紅細胞占全血容積的百分比(HCT)在冠心病的患者中比非冠心病患者中明顯降低，國外研究學者發現頸動脈斑塊形成的患者比無斑塊的患者HCT含量顯著降低。但Gotoh等認為無論是高水平還是低水平的HCT與都與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病有關，但是對于不同亞型的冠心病影響不同[21]。其中的原理還暫不清楚，可能是由于腦梗死人群和冠心病人群中氧化應激水平較高導致了血紅蛋白的破壞，而紅細胞破壞后釋放與氧化應激相關的酶，加重了氧化應激陷入了惡性循環[22]。在本實驗中血紅蛋白與斑塊評分的顯著差異只出現在腦梗死組，在斑塊組中并沒有體現，可能存在以下幾點原因：(1)急性腦梗死患者可以出現嚴重的應激反應，加重其對紅細胞的破壞；另外嚴重的應激反應可能對骨髓的造血有一定影響。(2)急性腦梗死患者通常會由于食欲較差或吞咽功能異常導致一定的營養障礙，也可能造成結果的不同。在非梗死組中高密度脂蛋白與斑塊的穩定性成正相關。傳統觀點認為高密度脂蛋白是一種保護性蛋白。動脈粥樣硬化斑塊的形成是炎癥反應或脂質代謝異常介導的大量脂質在血管壁內的異常聚集，所以高密度脂蛋白對膽固醇的反向運輸(從外周的單核巨噬細胞中運回到肝臟，再通過膽汁排泄)對動脈粥樣硬化的形成以及斑塊的不穩定性有阻斷意義。有些研究還認為高密度脂蛋白還可以通過其抗氧化、抗炎、抗血栓對動脈粥樣硬化起保護作用。但近些年高密度脂蛋白對動脈粥樣硬化的作用，以及其相關疾病的發病率的關系開始出現爭議。爭議問題主要為以下幾點：(1)有學者認為高密度脂蛋白對心腦血管疾病的保護作用不在于其血液濃度，而在于其功能強弱，故其存在一定的個體及人種差異。Favari[23]認為臨床中測量血清膽固醇的排泄率比測量血清高密度脂蛋白的濃度對腦血管、心血管等動脈粥樣硬化相關性疾病的預測與復發更有意義。在對上述疾病的治療方面，我們更不應該僅僅以增加血液中高密度脂蛋白的濃度為切入點，而應以增加血清膽固醇排泄率為標準。(2)Eduard[24]的研究表明不同亞型的高密度脂蛋白對頸動脈粥樣硬化斑塊的作用不一致。高密度脂蛋白主要有2個亞型，分別為HDL2-C，HDL3-C。HDL2-C與斑塊的厚度成正相關，也就是說它促進斑塊厚度的增加。HDL3-L與斑塊的厚度成反比，也就是說它對動脈有保護意義，且HDL3-C與動脈硬化相關疾病的的保護比總HDL-C相關性更強。

本實驗仍有不足之處，總體數量較少，各組之間數據收集欠完整，還需后續更多大樣本實驗繼續探索相關機制。

綜上所述：血清中CyPA水平是頸動脈粥樣硬化斑塊形成的危險因素，但與斑塊的穩定性不相關；腦梗死患者中的斑塊不穩定程度較非腦梗死患者斑塊不穩定程度明顯增加，提示斑塊破裂與腦梗死的發生息息相關；纖維蛋白原及糖化血紅蛋白會加重斑塊的不穩定性，而血紅蛋白和高密度脂蛋白是動脈粥樣硬化斑塊發展的保護因素。