CD4+CD28-T細胞、TNF-α、VCAM-1在急性腦梗死中的意義及其與頸動脈斑塊性質的相關性分析

郭艷俠， 國 娟

眾所周知，在腦梗死的發病機制中，動脈粥樣硬化占據重要作用[1]。而在動脈粥樣硬化形成及破裂的過程中，過度激活的炎癥反應加重腦梗死的發生發展，但具體的機制仍未明確[2]。研究表明，T淋巴細胞以及相關炎癥因子在動脈粥樣硬化過程中起到不容忽視的作用[3]。CD4+CD28-T細胞作為一種正性調控細胞通過介導促炎過程參與不穩定動脈粥樣硬化斑塊的形成，從而導致急性冠心病的發作[4]。TNF-α也是一種常見的促動脈粥樣硬化因子，但其作用機制尚不完全清楚。而VCAM-1參與白細胞與內皮細胞的粘附，并在動脈粥樣硬化的各個階段發揮重要作用[5]。因此，關于CD4+CD28-T淋巴細胞，TNF-α，VCAM-1在急性大動脈粥樣硬化型腦梗死發病機制中的作用仍值得探討，本研究通過對比分析不同類型急性腦梗死患者外周血中CD4+CD28-T細胞，TNF-α和VCAM-1水平變化，研究CD4+CD28-T細胞，TNF-α，VCAM-1與頸動脈斑塊性質的關系以及三者在急性腦梗死中的相關性，為急性腦梗死的診治提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年8月～2019年4月在中國醫科大學附屬盛京醫院神經內科住院的大動脈粥樣硬化型腦梗死患者57例，小動脈型腦梗死患者43例，均為首次發病并在24 h內收住院，男性59例，女性41例，年齡51～79(64.06±7.12)歲，符合第四屆腦血管病會議通過的診斷標準，并通過頭部CT和MRI檢查。另選取同期神經內科體檢者40例作為健康對照組，男性29例，女性11例，年齡45～67(56.60±6.86)歲。排除標準：(1)嚴重感染；(2)嚴重肝腎等疾病；(3)免疫系統疾病和腫瘤等疾病；(4)近期應用糖皮質激素或免疫調節等藥物；(5)TOAST分型為心源性，不明原因型和其他原因等導致的腦梗死。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集及檢測 所有受試者于入院后24 h清晨采集外周血，采用美國Becton Dickinson 公司生產的FACS Calibur流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群(CD4+CD28-)，應用美國 DSL公司生產的雙抗體夾心ELISA試劑盒測定血清TNF-α水平；采用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法檢測外周血血清VCAM-1水平；收集受試者相應年齡，性別，高血壓病史，TOAST分型，NIHSS評分等臨床資料，同時收集其入院的其他生化指標，包括血常規、腎功、血脂系列等。

1.2.2 頸內動脈多普勒超聲檢查 將所有大動脈型粥樣硬化型腦梗死患者于入院2 d內完善頸動脈多普勒超聲檢查，當一側頸動脈內膜中層厚度≥1.2 mm時提示斑塊形成，將斑塊分為穩定斑塊和不穩定斑塊[6]。穩定斑塊(硬斑塊)為超聲提示斑塊強回聲伴聲影、表面光滑、質地均勻；不穩定斑塊(軟斑塊)為超聲提示低回聲或回聲強弱不均、表面高低不平、質地不均勻等[7]。混合型斑塊(既有穩定斑塊又有不穩定斑塊)歸類為不穩定斑塊組。

2 結 果

2.1 一般資料比較 與健康組比較，大動脈粥樣硬化型腦梗死組和小動脈型腦梗死組年齡和高密度脂蛋白膽固醇水平增加，且差異具有統計學意義(P<0.05，見表1)；而大動脈粥樣硬化型腦梗死組較小動脈型腦梗死組年齡及入院NIHSS評分更高，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 CD4+CD28-T細胞、TNF-α、VCAM-1水平比較 與健康組比較，大動脈粥樣硬化型腦梗死組和小動脈型腦梗死組外周血CD4+CD28-T細胞、TNF-α、VCAM-1水平升高；與小動脈型腦梗死組相比，大動脈粥樣硬化型腦梗死組外周血CD4+CD28-T細胞、TNF-α、VCAM-1水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05，見圖1～圖3)。

2.3 頸內動脈斑塊比較 57例急性大動脈粥樣硬化型腦梗死患者中47例具有頸內動脈斑塊患者，其余10例無斑塊患者。19例患者檢出穩定斑塊，28例患者檢出非穩定斑塊，且不穩定斑塊組的外周血CD4+CD28-T細胞、TNF-α、VCAM-1水平高于穩定斑塊組，兩組差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表1 各組一般資料比較

注：與對照組相比aP<0.05，與小動脈型腦梗死相比bP<0.05

表2 穩定斑塊組和非穩定斑塊組CD4+CD28-T細胞、TNF-α和VCAM-1比較

2.4 CD4+CD28-T淋巴細胞、TNF-α、及VCAM-1之間的相關性 所有急性腦梗死患者的 CD4+CD28-T淋巴細胞和TNF-α通過散點圖分析其相關性，其中縱坐標為TNF-α，橫坐標為CD4+CD28-T淋巴細胞，散點圖結果提示兩者具有相關性，且呈線性相關，R2=0.743(見圖4，線性相關分析提示P<0.05)；CD4+CD28-T淋巴細胞和VCAM-1通過散點圖分析其相關性，其中縱坐標為VCAM-1，橫坐標為CD4+CD28-T淋巴細胞，散點圖結果提示兩者具有相關性，R2=0599(見圖5，線性相關分析提示P<0.05)，兩者之間相關性小于CD4+CD28-T淋巴細胞和TNF-α之間的相關性；而通過散點圖及線性相關分析可得TNF-α與VCAM-1之間無線性相關(P>0.05)。

圖1 CD4+CD28-T淋巴細胞水平在3組之間的比較(P<0.05)

圖2 TNF-α水平在3組之間的比較(P<0.05)

圖3 VCAM-1水平在3組之間的比較(P<0.05)

圖4 急性腦梗死患者CD4+CD28-T細胞與TNF-α之間的相關性(P<0.05)

圖5 急性腦梗死患者CD4+CD28-T細胞與VCAM-1之間的相關性(P<0.05)

3 討 論

目前，腦梗死仍是威脅人類生命生活的疾病之一，尤其是急性動脈粥樣硬化型腦梗死所致的大面積腦梗死的發生，對患者和其家庭造成了極大的負擔。目前大量研究表明，炎癥反應以及免疫反應對于腦梗死的發生發展起著重要的作用。對于腦梗死的研究，文獻報道參與動脈粥樣硬化相關損傷的免疫系統中最重要的細胞是單核-巨噬細胞和淋巴細胞[8～11]。已經有相關文獻提到T淋巴細胞亞群對類風濕關節炎[12]、系統性紅斑狼瘡[13]、和動脈粥樣硬化[14]等疾病的影響。此外，目前已有研究指出，CD4+CD28-T淋巴細胞和急性腦梗死之間存在一定的關聯[15，16]。由于CD4+CD28-T淋巴細胞是T細胞特殊的一類亞群，它可以促進動脈粥樣硬化發生發展，能夠導致斑塊破損，可能參與纖維帽破裂，并在冠心病患者中優先參與不穩定斑塊的形成[17]。由此我們認為，CD4+CD28-T細胞對急性大動脈粥樣硬化型腦梗死的產生有一定的調節作用，并且在一定程度上促進不穩定斑塊的形成。CD4細胞是一種輔助性T細胞，它對吞噬細胞的抗感染作用起到一定的調節作用，同時還能夠增加體液免疫反應。而CD28分子作為一種膜糖蛋白，幾乎只在T細胞中表達，同時它作為主要的共刺激受體，誘導和維持T細胞的激活以及效應功能的分化，當T細胞失去CD28的表達，是復制衰老的特征[18]。CD4+CD28-T淋巴細胞具有以下特性：(1)CD4+CD28-T細胞在一定程度上能夠抑制細胞凋亡，對機體具有十分重要的作用[19]。(2)CD4+CD28-T細胞可以刺激產生干擾素，干擾素進一步刺激巨噬細胞，誘導其活化，同時產生金屬蛋白酶，這是引起動脈粥樣硬化斑塊纖維成分遭到損壞的原因，并且容易引起斑塊結構的弱化和破裂[20]。(3)作為顆粒酶和穿孔素的來源，CD4+CD28-T淋巴細胞具有直接損傷靶組織的能力。總之，CD4+CD28-T淋巴細胞對于血管內皮細胞以及平滑肌細胞的損傷作用和動脈粥樣硬化斑塊的產生密切相關[21]，有關研究也指出，對腦梗死患者的外周血進行檢測，發現和對照組相比，大動脈粥樣硬化型腦梗死患者血中CD4+CD28-T淋巴細胞的含量明顯增多，頸動脈正常的腦梗死患者較對照組相比則呈現略高的結果，同時，CD4+CD28-T淋巴細胞和頸動脈粥樣硬化水平之間存在劑量效應關系，即隨著淋巴細胞的增多，動脈硬化水平也不斷增加，直到粥樣斑塊不穩定為最強[3]。

TNF-α是機體中重要的促炎癥細胞因子，它既能夠促進中樞神經系統的修復，同時也能對其造成一定的損害。大量研究表明。TNF-α在缺血性腦卒中的過程中具有十分重要的影響[22]。有文章提到TNF-α促動脈硬化的機制為在轉錄因子NF-κB和pPAR-γ的協調配合下，上調LDL在內皮細胞間的轉運，誘導LDL顆粒在血管壁的募集，進一步促進動脈粥樣硬化的生成[23]。另外，還有研究表明，對于冠心病患者來說，TNF-α和動脈粥樣硬化中不穩定斑塊的生成有一定關聯[24]。由此可見，對于急性腦梗死患者來說，TNF-α也許對TOAST分型的大動脈型粥樣硬化型腦卒中的患者有更強烈的作用，并且有可能在不穩定斑塊中具有更高的表達水平。TNF-α和CD4+CD28-T淋巴細胞之間也存在一定的關聯，有關研究表明，TNF-α能夠在一定程度上抑制T細胞CD28的表達情況，導致衰老細胞群體的出現，并且發現外源性TNF-α對骨髓CD4 T細胞的治療是有效果的[25]。對于急性腦梗死患者的TNF-α和CD4+CD28-T淋巴細胞的關聯，也有文獻報道CD4+CD28-T淋巴細胞可釋放IFN-γ，它和TNF-α作用后，刺激產生炎性反應，進一步增加對腦組織的損害，該過程對于腦梗死的進展發揮重要作用[26]。

動脈粥樣硬化是一種頑固性的炎癥反應，它主要是由于脂蛋白功能紊亂、血管平滑肌細胞(VSMCS)產生炎癥以及多種細胞成分共同作用后導致的，在血管內膜遭到破壞后，血管的內皮功能出現障礙，進一步分泌炎癥因子，從而引起血管平滑肌細胞的損傷，導致細胞的遷移和增生。一般來說，血管平滑肌細胞是利用細胞間粘附分子-1(ICAM-1)以及VCAM-1進入血管內膜，該過程是引起動脈粥樣硬化的主要原因。現如今，在研究動脈粥樣硬化斑塊的過程中，在血管平滑肌細胞檢測出了VCAM-1，它的出現對動脈粥樣硬化的炎癥反應以及免疫反應中有十分重要的意義[27]。有關研究對急性腦梗死患者的外周血進行了檢測，發現其VCAM-1含量明顯高于正常組，并且外周血中VCAM-1的含量和急性腦梗死患者的嚴重程度為正相關關系[28]。也有研究指出，VCAM-1在不穩定斑塊中的表達量明顯高于在穩定斑塊中的表達量[29]。有關文獻也探討并證實了VCAM-1和CD4+CD28-T淋巴細胞之間有一定的聯系[2]，這可能是由于CD4+CD28-T淋巴細胞在一定程度上能夠刺激促炎細胞分泌，特別是在急性腦梗死中，能夠誘導炎癥反應。而VCAM-1有細胞黏附性，這同樣可在一定程度上增強急性腦梗死的炎癥反應。

本研究結果提示，急性腦梗死患者在發病24 h內外周血中CD4+CD28T細胞，TNF-α以及VCAM-1水平較健康對照組升高，且根據TOAST分型，其在大動脈粥樣硬化型腦梗死的水平高于小動脈型，因此表明在腦梗死急性期，CD4+CD28-T細胞，TNF-α和VCAM-1作為炎性因子，主要參與了腦梗死急性期大動粥樣硬化的炎性反應過程，且通過超聲分析發現，CD4+CD28-T細胞，TNF-α及VCAM-1對不穩定斑塊的促炎作用更強烈。通過散點圖分析急性腦梗死患者CD4+CD28-T細胞，TNF-α及VCAM-1之間的關系發現，CD4+CD28-T細胞與TNF-α之間呈線性相關，CD4+CD28-T細胞與VCAM-1之間呈線性相關，且相關性小于前者，TNF-α與VCAM-1之間無明顯相關性，提示CD4+CD28-T細胞與TNF-α和VCAM-1在急性腦梗死患者的發病機制中相互作用，這與相關文獻的結果相符。本組資料也顯示急性大動脈粥樣硬化型腦梗死組患者年齡高于小動脈型，而兩組年齡均高于健康對照組。同時通過比較急性大動脈粥樣硬化型腦梗死組和小動脈型腦梗死組發現，前者NIHSS評分明顯高于后者。

綜上所述，CD4+CD28-T淋巴細胞，TNF-α和VCAM-1三個因子在腦梗死的急性期發揮重要作用。且CD4+CD28-T淋巴細胞與TNF-α和VCAM-1之間存在相互作用，且三者對TOAST分型為大動脈粥樣硬化型腦梗死作用大于小動脈型腦梗死，同時對不穩定型頸動脈斑塊的作用明顯強于穩定斑塊，因此，本實驗進一步說明CD4+CD28-T淋巴細胞，TNF-α和VCAM-1三者在腦梗死急性期的炎性反應和動脈粥樣硬化過程中發揮關鍵作用。