經典名方甘姜苓術湯中甘草苷含量的HPLC 測定

劉 鶴，賀丹彤，邢春來，何 蕊，劉 睿，成光宇，位 鴻*

（1.長春中醫藥大學藥學院，長春 130117；2 長春中醫藥大學附屬醫院中醫藥研究中心，長春 130021；3.長春中醫藥大學創新實踐中心，長春 130117）

甘姜苓術湯出自《金匱要略·五臟風寒積聚病脈證并治第十一》[1]，并被國家中醫藥管理局發布的《古代經典名方目錄（第一批）》收錄，全方由甘草、干姜、茯苓、白術組成，在治療類風濕性關節炎、盆腔炎、腎積水等方面具有良好效果[2-5]。甘草苷是甘姜苓術湯中有效且穩定存在的成分，本實驗建立了甘姜苓術湯中有效成分甘草苷的含量測定方法，并進行方法學驗證[6-9]，為甘姜苓術湯的質量控制提供實驗依據。

1 方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 美國Waters 公司2695 液相色譜儀，PDA 檢測器；KH-250DB 型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司)；CP225D 型電子天平（德國sartorius 公司）；Labconco Free Zone 冷凍干燥機（美國Labconco 公司）。

1.1.2 藥品與試劑 甘草苷對照品（批號：111610-201607，供含量測定用，規格：20 mg，購于中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、乙醇為色譜純，水為超純水；其它試劑均為分析純。

1.2 色譜條件與系統適應性 島津WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相乙腈（C）-0.05%磷酸水溶液，流動相比例0～8 min：19%C；8～45 min：19%～68%C；45～47 min：68%～90% C；47～55 min：90%C；55～60 min：90%～19%C；60～65 min：19% C；檢測波長237 nm；流速1.0 mL/min。進樣量10 μL；甘草苷的理論塔板數不低于5 000；柱溫為室溫。

1.3 對照品溶液的制備 精密稱取甘草苷對照品，加70%乙醇制成每1 mL 含0.02 mg 溶液，搖勻，即得。

1.4 供試品溶液的制備 按處方量取甘草28.0 g，白術28.0 g，茯苓56.0 g，干姜56.0 g（共計168.0 g），加1 000 mL 水，浸泡30 min，明火煎煮至沸騰轉為文火，煎至得煎液600 mL，冷凍干燥，得提取物粉末備用。

取提取物粉末（過四號篩）約0.1 g，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加70%乙醇8 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，即得。

2 方法學驗證

2.1 專屬性考察 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（色譜柱型號：Inertsil ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.05%磷酸水為流動相，梯度洗脫；檢測波長為237 nm[10]。

分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液、溶劑各10 mL，注入液相色譜儀，甘草苷分離度大于1.5，理論塔板數大于5 000，色譜圖見圖1、2、3、4。

2.2 線性關系考察 精密吸取甘草苷對照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、15.0、20.0 mL，注入液相色譜儀，測定，以進樣量（mg）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線[11]。回歸方程：Y=1 307.6X-2 861.5，r=0.999 7（甘草苷），甘草苷線性范圍為40.02～400.20 mg，試驗結果見表1、圖5。

圖1 溶劑專屬性考察

圖2 甘草陰性專屬性考察

圖3 甘草苷對照品專屬性考察

圖4 供試品專屬性考察

表1 線性關系考察

圖5 甘草苷標準曲線

2.3 穩定性考察 精密吸取對照品溶液和同一批供試品溶液各10 mL，分別在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h 進樣，依法測定[12]，以甘草苷峰面積積分值為指標，計算甘草苷RSD為0.43%，表明樣品中穩定性良好，24 h 內測定結果可靠，結果見表2。

2.4 精密度考察 精密吸取甘草苷對照品溶液10 mL，注入液相色譜儀，連續進樣6 次，依2.3 項下測定[13]，記錄峰面積積分值，計算得甘草苷對照品溶液連續測定的RSD 為0.74%，表明儀器、方法的精密度良好，結果見表3。

表2 甘草苷穩定性試驗

表3 甘草苷精密度試驗

2.5 重現性考察 精密稱取同一批樣品共6 份，按2.2供試品溶液項下制備，依法獨立測定[14]，以甘草苷為含量測定指標，計算樣品含量，結果RSD 為1.08%，平均含量為21.479 6 mg/g，表明該方法重現性良好，結果見表4。

2.6 準確度試驗 取重復性試驗同批樣品，取約0.05 g，共6 份，精密稱定，置10 mL 量瓶中，分別精密加入甘草苷對照品1.001 mg，加入70%乙醇，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，即得供試品溶液，依法測定[15]，計算平均回收率為99.74%，RSD 為1.60%，表明本法準確性較好，方法可行，結果見表5。

表4 重現性試驗

表5 回收率試驗結果

2.7 含量測定 取不同產地不同批次藥材飲片制備15批甘姜苓術湯提取物粉末，依法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 mL，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算15 批甘姜苓術湯提取物粉末中甘草苷含量[16]，結果見表6。

3 討論

3.1 流動相的選擇 本實驗考察對比了不同的流動相系統[17]，包括乙腈—水、乙腈-0.05% 磷酸水溶液；結果表明，以乙腈-0.05% 磷酸水溶液體系為流動相，采用梯度洗脫，能夠達到較好的洗脫效果，各色譜峰的峰形和分離度相對較好，故選用乙腈-0.05% 磷酸水溶液作為流動相系統。

表6 測定結果

3.2 檢測波長的選擇 精密吸取甘草苷對照品溶液10 mL，進樣分析，利用 PDA 檢測器進行全波長掃描[18]，測得最大吸收為237 nm，與2015版《中國藥典》“甘草”項下收載的檢測波長為237 nm 相符，因此選擇237 nm為檢測波長[19-20]。

3.3 結論 該方法建立了應用高效液相色譜法測定甘姜苓術湯中甘草苷含量的方法，該方法專屬性好，精密度、穩定性、加樣回收率均符合方法學驗證要求，可以作為甘姜苓術湯質量控制方法。