針康法對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠細胞凋亡相關因子表達的影響

劉 波，劉 穎，王 滌，邢學良

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，哈爾濱 150000；2.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040）

缺氧缺血性腦損傷（Hypoxic-ischemicbraindamage,HIBD）是指新生兒在圍產期或出生后因缺氧缺血而引起中樞神經受損的腦部疾病。近年來，已有證據證實細胞凋亡在缺氧缺血性腦損傷過程中發揮重要作用[1-2]。針康法是將頭穴叢刺與現代康復技術結合起來的治療方法，其對缺氧缺血性腦損傷患兒的運動、感覺、認知功能的提高及神經損傷的修復都發揮了重要作用[3]。動物實驗表明，針康法可以通過調節控細胞凋亡相關因子及細胞凋亡通路等方式來降低缺血缺氧發生后腦神經的損傷程度，發揮保護神經元的作用[4]。細胞凋亡誘導因子（AIF）及死亡基因受體（Fas）作為細胞凋亡相關因子，在缺氧缺血損傷發生后發揮促凋亡作用，阻礙神經元的修復與再生[5]。本實驗就缺氧缺血性腦損傷新生大鼠大腦皮質中的AIFmRNA、FasmRNA 及細胞凋亡情況進行研究，同時運用針康法對大鼠進行治療，探討針康法治療缺氧缺血性腦損傷的作用機制。

1 實驗材料

出生7 日齡Wistar 大鼠幼仔160 只，由遼寧長生生物科技有限公司提供，許可證編號：SYXK（遼）2010-0001，雌雄不限，體質量均在11～15 g。8%O2+92%N2混合氣體（哈爾濱鼎新工業氣體有限公司）；針灸針（0.25 mm×25 mm，北京中研太和醫療器械有限公司）；轉棒疲勞儀（上海欣軟）；超速冷凍離心機（湖南湘儀）；PCR 儀（杭州BIOER）；電泳儀（北京六一）；真空干燥箱（上海SYSBERTY）；凝膠成像分析儀（北京六一）；CX41 型生物顯微鏡（日本OLYMPUS）。Tunel 凋亡試劑盒（武漢博士德公司）；總RNA 提取試劑盒（Trizol 法）；AIF、Fas 及GAPDH 引物合成（上海生工生物工程有限公司）；逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen）。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備 建立HIBD 的Rice-Vannucci 模型和假手術模型[6]。將出生7 日齡Wistar 大鼠幼仔采用無水乙醚吸入麻醉方式進行麻醉（1.0～2.0 min），仰臥位固定，充分暴露頸部。局部碘伏消毒后，沿頸正中線剪開皮膚及皮下組織，分離出左側頸總動脈，用0 號絲線行左側頸總動脈雙結扎后縫合頸部皮膚。術后將大鼠幼仔置于帶有母鼠氣味的窩中恢復2 h，然后再將大鼠幼仔放入37 ℃的有機玻璃缺氧箱中，持續充以氣流量為1 L/min 的8%氧氣，92%氮氣混合氣體2 h。建模后，將出現夾尾左旋的大鼠幼仔納入實驗。假手術組則只需要剪開大鼠頸部的皮膚并分離出左側頸總動脈，不結扎，縫合皮膚后也不予缺氧處理，結束后放回母鼠籠中喂養。

2.2 分組及干預方法 將7 日齡Wistar 大鼠幼仔隨機分為假手術組、模型組、針刺組、康復組與針康組5組，每組按建模后觀察時間點的不同又分為12、24、48、72 h 這4 個亞組，每個亞組8 只大鼠幼仔。假手術組手術后回籠飼養，予以同等條件下的抓取。模型組造模后回籠飼養，予以同等條件下的抓取。針刺組造模后采用頭穴叢刺針法對大鼠幼仔進行治療。采用1.0寸針灸針，取百會穴及百會穴左、右側各旁開1 mm處進行針刺，快速捻轉1 min后留針2 h，每日針刺1次。康復組予大鼠幼仔以轉籠、轉棒等綜合康復訓練療法。轉籠為長100 cm，直徑為60 cm 的金屬圓柱形網籠，網籠分為4 格，可同時訓練4 只大鼠幼仔。在進行轉籠訓練時可將轉籠水平放置于金屬架上，轉動轉籠一端的轉動柄，按需要轉動縱軸，每天訓練10 min。轉棒為一根長75 cm，直徑為4.5 cm 的木棒，進行轉棒訓練時，將轉棒兩端懸掛，手動以5 r/min 的速度順、逆時針交替轉動木棒，每天訓練10 min。針康組在造模后采用針康法進行治療。在大鼠幼仔頭穴叢刺針留針期間進行康復訓練，1 次/d（針刺方案同針刺組，康復訓練方案同康復組）。

2.3 采用RT-PCR 法檢測大腦皮質中AIFmRNA 及FasmRNA 的表達水平 各組大鼠在治療結束后按規定時間點斷頭取腦，之后將左側大腦皮質快速剝離。取材結束后按照總RNA 試劑盒說明書，運用Trizol法提取總mRNA，并進行電泳以檢測RNA 的完整性，之后在逆轉錄反應這一環節合成對應的cDNA，其操作方法也參照試劑盒說明書進行，最后，當聚合酶鏈反應結束時配制瓊脂糖凝膠進行電泳，運用凝膠成像系統對得到的凝膠進行拍照并分析數據。各引物序列見表1。

表1 AIF、Fas、GAPDH 引物序列

2.4 原位末端標記法（TUNEL 法）檢測大腦皮質中細胞凋亡變化 在規定時間點，大鼠乙醚麻醉后開胸，暴露心臟，剪開右心耳后將提前準備好的帶有20 mL生理鹽水的注射器插入至左心尖以沖洗血流，隨后灌入20 mL 的4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PA）溶液，待灌注結束，迅速斷頭取腦剝離大腦皮質并置于4%PA溶液中充分固定。48 h 后行脫水、浸蠟、石蠟包埋，將樣本制成5 μm 切片，之后進行TUNEL 染色，具體操作參照說明書。凋亡細胞，即陽性細胞在光鏡下呈棕黃色或棕褐色，非凋亡細胞，即陰性細胞呈藍色。在高倍鏡（10×40）下每只大鼠隨機選取5 張皮質切片以觀察細胞凋亡的數量，后取均值作為統計參數。

2.5 統計學方法 所有數據均通過SPSS 19.0 軟件進行分析，各數據均以均數±標準差（）的形式表示，多組間比較選用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用TukeyHSD 法，計量資料分析應用Pearson相關系數。

3 結果

3.1 不同時間點各組新生大鼠腦皮質中AIFmRNA與FasmRNA 的表達變化 見表2、表3。隨著缺氧缺血損傷時間的延長，假手術組在各時間點的AIF、FasmRNA 表達均不明顯，其余各組的AIF、FasmRNA在12 h 開始逐漸上升，并在24 h 時達到高峰，之后在48 h 和72 h 逐漸下降。與假手術組相比較，其余各組的AIF、FasmRNA 在各時間x 點的表達差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，針刺組、康復組與針康組在各時間點的AIF、FasmRNA 表達差異有統計學意義（P＜0.05）；針康組與針刺組、康復組比較，其在各時間點的表達,差異也具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 不同時間點各組AIFmRNA 與GAPDHmRNA 的比值比較（，n=8）

表2 不同時間點各組AIFmRNA 與GAPDHmRNA 的比值比較（，n=8）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與針刺組比較，▲P ＜0.05；與康復組比較，□P ＜0.05

3.2 不同時間點各組新生大鼠腦皮質細胞凋亡情況 因大腦皮質為細胞凋亡的易發區且對缺氧缺血損傷較為敏感，故本實驗選取皮質進行細胞凋亡檢測。如表4 所示，除假手術組，其余各組的細胞凋亡數均在12 h 逐漸上升，并在24 h 時到達高峰，之后在各時間點逐漸下降。與假手術組相比，其余各組在各時間點內的細胞凋亡數均具有顯著差異（P＜0.05）；后3組在各時間點與模型組相比，其細胞凋亡數明顯減少，有統計學意義（P＜0.05）；針康組的細胞凋亡數與針刺組及康復組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表3 不同時間點各組FasmRNA 與GAPDHmRNA 的比值比較（，n=8）

表3 不同時間點各組FasmRNA 與GAPDHmRNA 的比值比較（，n=8）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與針刺組比較，▲P ＜0.05；與康復組比較，□P ＜0.05

表4 不同時間點各組凋亡陽性細胞數的比較（個/400 倍）（，n=8）

表4 不同時間點各組凋亡陽性細胞數的比較（個/400 倍）（，n=8）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與針刺組比較，▲P ＜0.05；與康復組比較，□P ＜0.05

3 討論

針康法是傳統針灸技術與現代康復技術的結合，具有同步性、動態性、整體性等特點。針康法治療內容的核心是，通過針刺刺激大腦皮層不同的反射區，加快大腦微循環的建立，并結合相應的運動功能訓練、感覺功能訓練等現代康復治療方法，二者共同發揮效用，以非侵入的形式刺激中樞神經系統，從而達到促進大腦受損區域神經組織修復的目的[7]。并有研究表明，針康法可以通過促進神經軸突的重塑、維持細胞的存活、減少細胞凋亡、調控神經營養因子的濃度，降低腦損傷后出現的炎癥反應，進而促進缺氧缺血腦組織神經功能的修復與再生[8]。

本次實驗結果顯示，針康法可以通過調節缺氧缺血性腦損傷新生大鼠大腦皮質內AIF 與Fas 的表達來發揮抑制細胞凋亡作用。AIF 是一種線粒體黃素蛋白，具有調節細胞凋亡和維持線粒體功能的作用[9-10]。當細胞發生凋亡時，AIF 通過非Caspase 依賴性凋亡方式從線粒體中釋放并轉移至細胞核內，在細胞核中AIF 促進DNA 降解成20 至50-kb 并因此誘導細胞解體所需的染色質凝聚[11-12]。YANG C X 等[13]研究證實，AIF表達下調時可以增加腦缺氧缺血損傷后新生兒腦內細胞的存活率，減少細胞凋亡的發生。并且關于本實驗中AIFmRNA 在各時間點的表達趨勢和AIFmRNA 在各時間點的動態變化與缺氧缺血性腦損傷后腦內細胞凋亡變化規律吻合這兩個發現，都與徐艷等[14]研究參附注射液對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠AIF 表達變化的結果一致。提示針康法可以通過抑制AIFmRNA 的表達減少細胞凋亡的發生，發揮腦保護作用。另外，細胞凋亡不僅與AIF 有關，更與細胞表面的死亡受體Fas 有關。Fas 作為細胞表面具有轉膜作用的蛋白，屬于腫瘤壞死因子（Tumornecrosisfactor,TNF）受體家族。當Fas 的胞外域與其結合配體FasL 結合時可引發細胞凋亡。Fas-FasL 結合可誘導Fas 的局部結構發生變化，從而使Fas 的細胞內死亡域（FasDD）和Fas 相關死亡域（FADD）相互作用，最終激活細胞內源性和外源性兩種凋亡途徑以實現細胞凋亡[15]。馬飛等[16]已證實，當腦組織發生缺血損傷時可促進Fas 表達上調，而當下調Fas 表達水平時可抑制腦缺血損傷后神經元的凋亡。這說明腦缺氧缺血性損傷可誘導Fas 參與細胞凋亡的調節過程。此外，有關本實驗中FasmRNA 在24 h時達到表達高峰，后逐漸下降的這一表達趨勢與各時間點細胞凋亡趨勢一致的結果，與秦彥強等[17]研究針刺預處理對急性MACO 大鼠細胞凋亡影響的有關結果吻合。說明針康法可以通過調控FasmRNA 的表達來避免凋亡的發生，更好的保護腦組織。

細胞凋亡是一種高度調節和能量依賴的程序性細胞死亡（Programmedcelldeath,PCD），對早期胚胎發育和組織穩定至關重要[18-19]。細胞在受損后是否發生凋亡，是由促凋亡因子與抗凋亡因子二者誰能更好的發揮主導作用所決定的，在該過程中如果實施有效的干預抑制促凋亡因子，則可最大程度的保護腦組織，減少損傷[20-21]。本實驗結果顯示，各時間點針康組細胞凋亡數較模型組、針灸組及康復組顯著減少（P＜0.05），說明針康法可有效減少缺氧缺血性腦損傷新生大鼠細胞凋亡數。

綜上所述，通過本實驗可進一步闡明針康法抑制缺氧缺血性腦損傷新生大鼠細胞凋亡的機制。針康法不僅能下調AIFmRNA 的表達水平，而且還能下調FasmRNA 的表達水平，從而減少細胞凋亡的發生，促進受損神經細胞的修復與再生。