雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體靶向肺癌干細胞和肺癌細胞研究

黃小龍 萬姍

肺癌屬于一種嚴重威脅著人類生命健康的惡性腫瘤之一，是癌癥死亡的主要原因，其發病率和死亡率與其他惡性腫瘤相比居于首位，大約占全部惡性腫瘤的20%左右[1]。目前臨床上迫切需要解決的問題為需要有效的治療肺癌的方案，但由于肺癌的復發、多藥耐藥以及癌細胞轉移等增加了肺癌的治療難度，嚴重影響著肺癌患者生命安全[2]。CD133基因是位于人類4號染色體上，包含有37個外顯子，屬于細胞膜蛋白的超家族成員，含有8665個氨基酸，其分子質量為120ku[3]。EGFR屬于一種表皮生長因子的受體，其所介導的信號轉導通路和細胞的增殖、分化、生存具有一定的相關性[4]。吉非替尼屬于一種選擇性EGFR酪氨酸激酶抑制劑，酪氨酸激酶抑制劑屬于肺癌的標準治療方法，且對于突變型的非小細胞肺癌的治療效果較好[5]。吉非替尼是通過選擇性的抑制EGFR-TK所介導的信號傳遞通路發揮其作用[6]。因此在本文中設想利用CD133、EGFR在肺癌組織中的表達特性來，對肺癌細胞進行雙靶向處理，以研究雙靶向吉非替尼對肺癌細胞增殖的作用。

資料與方法

一、材料

研究細胞：肺癌A549細胞、A431細胞(上海紀寧實業有限公司)，本次研究經過我院倫理委員會批準。

主要試劑：吉非替尼(大連梅倫生物技術公司)；生理紅蛋白標記的CD133、EGFR抗體和CD133、EGFR微珠套件(Miltenyi Biotec公司)。

二、方法

1 吉非替尼納米載體的制備 首先將10 mg磷脂聚乙二醇嵌段共聚物和2 mg吉非替尼溶解于5 mL氯仿中，旋轉蒸發儀除掉氯仿后，加入5 mL的磷酸鹽緩沖液水化磷脂膜，并通過聚碳酸脂膜過濾后獲得吉非替尼納米載體。

2 雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體的制備 參照文獻[7]制備雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體，通過碳化二亞胺法制備靶向納米載體，將CD133核酸適體(0.05 mg)、EGFR核酸適體(0.05 mg)、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺，0.02 mg)、NHS(N-羥基丁二酰亞胺，0.02mg)加入到1mL上述獲得的納米載體中，在磁力攪拌條件下室溫孵育。加入純水離心到一定體積，通過15 mL的超濾離心柱(截留分子量為100kDa)除掉游離EDC和NHS以及游離狀態的核酸適體，獲得雙靶向吉非替尼納米載體。CD133或EGFR單靶向或無靶向的吉非替尼納米載體制備方法同上。

3 吉非替尼載藥量和包封率的測定 取冷凍干燥納米載體并稱重。再將其溶解于乙腈后，采用C18色譜柱，磷酸氫二鉀/甲醇(10/90，v/v)，流速1.5mL/min，柱溫30℃，檢測波長246nm，20μL進樣高效液相色譜儀測定納米載體吉非替尼含量，由此計算吉非替尼載藥量和包封率。包封率的計算方法：包封率是指包入納米載體內的藥物量與投料量的重量百分比，包封率=W包/W投*100%(W包指包裹進入的吉非替尼的質量；W投指投入的吉非替尼的總質量)。載藥量的計算方法：載藥量是指一定重量的納米載體所包封的藥物重量百分比，載藥量=W包/W納米載體*100%(W包指包裹進入的吉非替尼的質量；W納米載體指處方納米載體的總質量)。

4 納米載體的粒徑及zeta電位的測定 分別取5μL的納米載體溶液或稀釋溶液(視情況可能需要用MilliQ水稀釋)，加入到100目的銅網。當室溫蒸干水分后，樣品用質量分數為2%的磷鎢酸鹽酸溶液染色，通過透射電鏡觀測納米載體的粒徑及粒徑分布。取5μL的納米載體溶液，用1mL的MilliQ水稀釋后，直接用馬爾文粒徑儀測定納米載體的粒徑和zeta電位。

5 吉非替尼釋放測定 將2mg的納米載體分別重懸在5 mL PBS中，放置在恒溫水浴搖床中(37℃，100 rpm)，在特定時間點時，將4mL納米載體溶液在11500 rpm離心45min后，將上清取出揮干，經乙腈溶解后用HPLC測定吉非替尼含量，再加入等量的新鮮PBS溶液繼續測定釋放。

6 肺癌細胞的培養與干細胞分選 在37℃孵箱中，以10%胎牛血清培養肺癌A549和A431細胞系。分別加入FITC標記的抗CD133抗體到以上消化后的細胞株，加PBS溶液，洗滌離心，流式上機，計算陽性百分率和平均熒光強度。以CD133免疫磁珠分選出CD133陽性的肺癌細胞，

7 雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體在肺癌細胞中的蓄積效率 將5×104肺癌細胞鋪板，在CO2孵箱繼續培養過夜。將一定濃度的納米載體分別加入單層細胞中，繼續分別培養4小時，清洗并收集細胞至離心管中，超聲粉碎細胞后離心，取出上清并揮干，經乙腈溶解后用高效液相色譜測定吉非替尼含量，評價納米載體在肺癌細胞內的蓄積效率。

8 雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體對肺癌細胞克隆球生長的影響 取對數生長期的肺癌細胞，用PBS洗干凈后胰酶消化，離心。采用血球計數板對細胞進行計數。接種，加入納米載體，剩余1個孔不做處理。孵育，消化細胞，計數。在7天時，計數肺癌細胞克隆球形成數。克隆球形成率=微球體個數/接種的單個細胞數×100%。

9 雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體對肺癌細胞殺傷作用 取肺癌細胞系細胞，在96孔板中鋪板，100μL/孔(3×103/孔)，每種細胞93個孔(3個孔為未處理組；另外90個孔作為實驗組，共10個濃度，3個復孔，3種藥物)，在37℃，5%CO2中培養過夜。兩倍比稀釋納米載體以及游離吉非替尼分別加入細胞中。培養72小時，通過CCK8細胞增殖檢測試劑盒，讀取450nm處吸光度，計算各藥物組的IC50值。細胞生存率計算公式：(實驗組OD450-空白組OD450)/(未處理組OD450-空白組OD450)×100%。

三、統計學處理

結 果

一、不同載藥納米載體包封率、載藥量、粒徑、zeta電位比較

雙靶向吉非替尼納米載體組包封率、粒徑均高于吉非替尼納米載體組，載藥量、zeta電位低于吉非替尼納米載體組，具有統計學差異，P<0.05(見表1)。

表1 兩種載藥納米載體包封率、載藥量、粒徑、zeta電位比較

二、不同載藥納米載體圖

圖1 不同載藥納米載體圖

三、 包裹吉非替尼后透射電鏡圖

吉非替尼納米載體膠束的透射電鏡圖，由圖可知，納米載體的粒徑大小較為均勻，形態呈現為球形。雙靶向吉非替尼納米載體膠束的透射電鏡圖，由圖可知，納米載體的粒徑大小較為均勻，形態呈現為球形，分散性較佳(見圖2)。

圖2 包裹吉非替尼后透射電鏡圖

四、 不同載藥納米載體中的吉非替尼釋放量比較

兩組載藥納米載體中的吉非替尼在各時間點的釋放量比較，無統計學差異，P>0.05(見表2)。

表2 不同載藥納米載體中的吉非替尼釋放量比較(%)

五、不同載藥納米載體在肺癌細胞內的蓄積效率比較

雙靶向吉非替尼納米載體組在肺癌A549細胞、A431細胞中的蓄積效率均高于吉非替尼納米載體組，具有統計學差異，P<0.05(見表3)。

表3 不同載藥納米載體在肺癌細胞內的蓄積效率比較(%)

六、不同載藥納米載體對肺癌細胞克隆球形成的影響

雙靶向吉非替尼納米載體組肺癌A549細胞、A431細胞克隆球形成率均低于吉非替尼納米載體組，具有統計學差異，P<0.05(見表4)。

表4 不同載藥納米載體對肺癌細胞克隆球形成的影響(%)

七、不同載藥納米載體對肺癌細胞生存的影響

雙靶向吉非替尼納米載體組肺癌A549細胞、A431細胞在各時間點的存活率均低于吉非替尼納米載體組，具有統計學差異，P<0.05(見表5)。

表5 不同載藥納米載體對肺癌細胞生存的影響(%)

討 論

腫瘤組織中存在較多的肺癌干細胞，參與肺癌的存活、肺癌癌細胞增殖、轉移以及肺癌復發等過程，導致肺癌復發轉移、放化療抵抗等事件的發生，且肺癌干細胞在上述過程中具有較為關鍵的作用，因此靶向肺癌干細胞可能會提高肺癌的藥物效果[8]。

CD133包括CD133-1、CD133-2兩個亞型，其中CD133-1在成人骨骼肌、胎兒腦組織中含量較高，但在胎兒腎臟、肝臟和成人胰腺等器官組織中未檢測到表達；CD133-2在多種成人組織、胎兒組織中含量較高[9-10]。CD133屬于一種5次跨膜糖蛋白，是傳統的造血干細胞、血液腫瘤和內皮祖細胞包括肺癌干細胞的表面標志物[11]。由于腫瘤細胞具有類干細胞的特點，對目前臨床上多種腫瘤的放療、化療治療均會出現不同程度上的敏感性，但大多數表現不敏感。在肺癌的治療過程中，存在小部分癌細胞可逃避抗癌藥物的作用，且可在短時間內形成新的癌細胞，新生的癌細胞對先前的治療產生更強的耐受性[12]。CD133陽性腫瘤干細胞具有腫瘤干細胞的特性，且對放化療均不敏感[13]。與CD133陰性肺癌相比，CD133陽性肺癌細胞的干性基因表達，腫瘤克隆球成球能力和裸鼠成瘤能力均顯著提高，證實CD133陽性肺癌細胞有肺癌干細胞的特性。因此，CD133可作為有效靶點用于靶向肺癌干細胞。

EGFR參與多種腫瘤的發生和發展，且和患者的預后有關。目前臨床上有研究表明，在肺癌組織中EGFR的表達顯著高于正常肺組織，此結果提示臨床上可利用EGFR在肺癌組織中的高表達特性來對肺癌細胞進行靶向處理，以起到抑制肺癌細胞增殖的作用[14-16]。因此我們設想：將EGFR核酸適體和我們前期構建的CD133靶向納米載體相連，構建成為雙重靶向并殺傷肺癌細胞與肺癌干細胞的靶向磷脂膠束納米載體，預期可以更好實現肺癌的治療。帶有配體(如適配體或抗體)的靶向納米粒子由于能提高其他藥物的靶向性而引起了廣泛的關注[17]。雖然反波在靶向納米粒子中有著廣泛的應用，具有強的免疫原性等缺點。適配體是一種寡核苷酸，具有低免疫原性、低分子性等優點。重量，容易生產，使他們成為理想的目標配體[18]。該適配體A15已被證明是一種很有前途的配體，可靶向CD133細胞[19]。鑒于CD133是我們推測A15-CD133相互作用可以介導藥物有效地傳遞到CD133陽性的肺干細胞。核酸適體是經體外篩選出的能特異結合蛋白質的寡聚核苷酸片段，有實驗研究篩選出一種CD133靶向性核酸適體，可實現對CD133的高度特異性靶向[20]。

在本文研究中，從雙重靶向殺傷肺癌細胞與肺癌干細胞方向研究，在構建的CD133靶向磷脂膠束納米載體基礎上，構建成為遞送吉非替尼的雙重靶向并殺傷肺癌細胞與肺癌干細胞的靶向磷脂膠束納米載體，實現對肺癌的靶向性治療。分析雙靶向納米載體的納米表征，檢測體內外對肺癌細胞的靶向親和效力、雙重殺傷活性和抗腫瘤作用。本文研究顯示，制備雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體，結果顯示雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體可雙靶向殺傷肺癌細胞，具有較強的抗腫瘤作用，但目前腫瘤干細胞與普通腫瘤細胞雙重靶向的納米給藥系統應用于肺癌治療，目前國內外尚無研究報道，因此本文研究結果還需后續研究實驗進一步證明。

綜上所述，雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體可雙靶向殺傷肺癌細胞，具有較強的抗腫瘤作用。