MicroRNAs 參與慢性阻塞性肺疾病發病機制的研究進展

彭玲 綜述 周超 審校

引 言

一、慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease COPD)俗稱慢阻肺，最早由 Briscoe等在“慢性支氣管炎、肺氣腫、哮喘”的基礎上提出，將其定義為一種以持續氣流受限為特征的，可以預防和治療的疾病[1]。臨床上主要以異常的慢性氣道炎癥、小氣道重塑、肺泡破壞為病理特征。

二、MicroRNAs(miRNAs)是一類小的非編碼RNA,一般由 18～25個核苷酸組成，可通過抑制信使RNA(mRNA)的翻譯或誘導其降解而影響調控機體幾乎所有的生物過程。據統計，miRNAs調控人體幾乎60%的基因[2]。以往研究發現miRNAs在由單核細胞向多核細胞進化前就已出現，其產生可通過膜囊泡包裹主動分泌、蛋白miRNAs復合體及脂蛋白復合體主動分泌、外泌體主動分泌、細胞凋亡裂解后被動分泌[3]。此外，人們普遍認為miRNAs不僅可在某一特定的細胞或組織中起作用，而且可在細胞外囊泡(ExtracellularVesicles, EVs)中活躍地轉運。EVs是細胞旁分泌產生的一種亞細胞成分，包括外泌體、微囊泡、凋亡小體等組分，可來源于幾乎所有細胞類型(如上皮細胞源性EVs、巨噬細胞源性EVs、內皮細胞源性EVs等)。因miRNAs可廣泛且穩定地存在于血清、血漿、關節液、唾液等體液中[4-5]。現階段研究已證實miRNAs主要通過與靶基因 mRNAs結合抑制其翻譯或促進其降解，對機體 mRNA的穩定及翻譯效率起重要調節作用。目前的諸多研究表明，miRNAs可通過多種途徑參與慢阻肺的發生與發展(見圖1)。

MicroRNAs與慢阻肺的病理生理

一、miRNAs與煙霧暴露

煙霧暴露是目前公認的與慢阻肺發病相關的主要危險因素之一，經研究證實，重度吸煙人群，慢阻肺的發病率是不吸煙人群的5倍。首先煙霧吸入會刺激肺上皮細胞，導致促炎細胞因子的釋放，從而引發先天和獲得性炎癥反應(innate and adaptive inflammatory responses)。其次，煙霧刺激肺部炎癥反應，可增加機體活性氧(ROS)的產生，從而促進與慢阻肺有關的病理生理變化，這最終將導致鱗狀化生、成纖維細胞活化、粘液產生和氣道重塑[4]。

目前，包括miRNAs在內的表觀遺傳學機制已受到廣泛學者的關注，其中組蛋白乙酰化和去乙酰化是基因轉錄的關鍵調節因子，若兩者表達失衡，則易導致吸煙者慢阻肺人群的基因表達譜發生改變。Stolzenburg LR等人也發現吸煙者肺中miR-223升高，而miR-223表達的升高與組蛋白去乙酰化酶 2(HDAC 2)表達降低有關，HDAC 2活性的降低會導致炎癥和皮質激素抵抗的擴大化。同時他們還發現吸入香煙煙霧后，呼吸道組織樣本中的miR-101也有所增加[4,6]。Graff JW 等比較吸煙者與不吸煙者肺泡巨噬細胞miRNAs的表達情況后發現，吸煙者肺泡巨噬細胞中有包括 miR-132、miR-139 在內的11個 miRNAs的表達升高，有包括 miR-452、miR-129-3p在內的 43 個 miRNAs表達降低。這種差異性表達，提示我們 miRNAs可能在慢阻肺的發生發展及表觀遺傳機制中存在潛在的致病作用[7]。

另一項關于健康受試者、吸煙無癥狀者及慢阻肺患者體內miRNAs表達差異的實驗研究數據表明，在慢阻肺患者和無癥狀吸煙者中,血清miR-21的表達水平明顯升高，而miR-181a的表達水平則明顯下降。并推測 miR-21與 miR-181a的比值升高可作為重度吸煙者罹患慢阻肺的早期診斷標志[8]。此外，有研究發現慢阻肺吸煙患者痰中let-7c靶基因(腫瘤壞死因子受體II 型(TNFRII))表達增加，且與let-7c表達呈負相關，并證實煙草提取物可引起人支氣管上皮細胞中miR-200c表達的下調，誘導人支氣管平滑肌細胞 miR-7表達及miR-135b過表達，參與體內炎癥反應的發生[9-10]。一項基于煙霧暴露小鼠戒煙前后miRNAs變化趨勢的研究發現，煙霧誘導的 miRNAs變化是劑量依賴性的，且只有部分miRNAs可逆，大多無法恢復到基礎水平，比如 miR-34b、miR-345、miR-421、miR-450B、miR-466 和 miR-469在戒煙1周后均未出現明顯改變[11]。因此，miRNAs譜的變化可能與煙霧暴露所致的肺組織損傷和炎癥程度相關。

以上多項研究結果表明，煙霧暴露與體內miRNAs的差異表達密切相關，然而有趣的是，miRNAs不僅調控正常的基因表達，還越來越多地被發現參與表觀遺傳機制。進一步對miRNAs與表觀遺傳學聯系的研究也發現，miRNAs 與經典表觀遺傳學機制(如DNA 甲基化與去甲基化、組蛋白乙酰化與去乙酰化)之間存在復雜的相互作用，最新的研究亦證實在慢阻肺患者血液、痰和肺組織中，DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNAs都存在明顯的異常表達，提示miRNAs具有調節表觀遺傳機制的潛力[10]，或許可作為吸煙患者罹患慢阻肺的早期預測因子。然而就目前研究可知，戒煙雖可以延緩疾病的發展，但現在還沒有治愈慢性阻塞性肺疾病的方法，而且目前的藥物也無法逆轉長期的肺功能下降。所以，進一步研究miRNAs和表觀遺傳機制之間復雜的相互作用及其在體液、組織中的改變或許能夠提示慢阻肺患者吸煙劑量并作為罹患或預后的預測因子。

二、miRNAs與炎癥反應

小氣道持續且過度的炎癥反應是慢阻肺的主要病理特征之一。正常生理情況下，機體對外界的有害物質或有害氣體的刺激會產生適當的炎癥反應(一種保護性反應)，而在這種適當的平衡狀態中，反饋調節的存在至關重要。近年來隨著人們對于miRNAs探索發現，miR-135可通過3'UTR降低白介素-1 受體(IL-1R)的表達和抑制白介素-1(IL-1)信號傳遞靶點參與機體炎癥反應的負反饋調節機制[2]。

為進一步了解miRNAs與炎癥反應的關系，一項轉染 miR-21的 T細胞亞群的研究發現， miR-21的轉染可導致腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)表達上調，加重機體炎癥反應[6]。此外，miR-218可與腫瘤壞死因子受體1(TNF-R1)的3'UTR結合，阻斷TNF-R1 所誘導的 IL-6、IL-8的釋放及核轉錄因子kappa B(NF-κB)活性增強而減輕毛細支氣管炎癥反應。miR-146也被證實參與 NF-κB 信號通路的調控，當 miR-146低表達時， NF-κB 過度活化，導致環氧化酶-2(COX-2)半衰期延長，降解減少，(COX-2 是前列腺素E2(PGE2)生物合成的關鍵酶，而 PGE2 是中性粒細胞合成的啟動子)中性粒細胞產生增多， 從而導致炎癥反應的不平衡化[12]。Park H 等人也證實 miR-146a和 miR-146b的過表達可靶向作用于 TRAF 6 和 IRAK 1蛋白，從而抑制炎癥細胞因子(如 IL-12p70、IL-6、TNF-a 和 IFN-g)的分泌[13]。

正常情況下，人體在發生炎癥時，炎癥因子可通過Toll樣受體 4(TLR4)信號通路，激活凝脂酰基醇激酶3(PIK3)，將蛋白激酶 B(PKB)磷酸化為磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PAKt)從而抑制miR-199的表達。而過度的炎癥刺激則會抑制機體TLR4信號通路，導致 miR-199表達上調，由此我們猜測miR-199或許可作為炎癥反應強度的預測因子[14]。MiR-181c的高表達被證實可通過靶向富半胱氨酸肝素結合蛋白61抗體(CCN1),減輕機體炎癥反應，減少中性粒細胞的浸潤，減少活性氧的生成，提示其很有可能作為靶向治療的目[2]。

因此，miRNAs 可通過多種途徑參與慢阻肺患者炎癥反應的調節過程，這將為我們提供靶向改善機體異常炎癥反應的切入點。

三、miRNAs與氣道重塑

氣道重塑是機體在反復炎癥刺激下氣管壁的自我修復功能紊亂的結果，主要以小氣道重塑為主，進而出現管腔狹窄，氣流受限。目前研究顯示氣道重塑的主要機制包括以下幾個方面：蛋白酶-抗蛋白酶失衡、自身免疫機制、氧化應激、氣道平滑肌功能失調[15-16]。

α1-抗胰蛋白酶是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，對炎癥反應有一定的限制作用。研究發現，慢阻肺患者血清中miR-132和miR-212表達上調，而α1-抗胰蛋白酶mRNA與miR-132、miR-212的表達呈負相關，表明α1-抗胰蛋白酶mRNA為 miR-132、miR-212的作用靶點[17]。SMAD是TGF-β超家族成員信號轉導過程中的關鍵分子，與氣道平滑肌增殖和氣道重塑關系密切。miR-145已被證明不僅具有調節肌成纖維細胞分化和肺纖維化的作用，還可負向調節并釋放前炎細胞因子，前炎細胞因子可通過促發慢性阻塞性肺病患者氣道平滑肌細胞中SMAD3的釋放，從而加速氣道重塑[12]。而miR-23b可通過 TGF-β2、磷酸化SMAD3(PSMAD3)等信號通路調控 TGF-β1 所誘導的氣道重塑，即 miR-23b可負反饋調節 TGF-β2，抑制氣道重塑[17]。此外，一項敲除 miR-155的小鼠實驗發現，miR-155的缺失會導致B淋巴細胞、T淋巴細胞的反應喪失，以及輔助性T細胞向Th2型細胞分化缺失，表現為免疫缺陷和大量氣道重塑，加快慢阻肺患者病情的發展[18]。研究發現miR-145可參與平滑肌細胞的分化、可塑性、表型分化，參與嗜酸性粒細胞炎癥的調節及過敏性氣道炎癥性疾病粘液的分泌調節。miR-145的高表達可促進α-平滑肌蛋白(α-SAM)的表達，增強肺成纖維細胞的收縮能力，促進局部纖維粘連，而miR-210可通過自噬和促進肌成纖維細胞分化促進氣道重塑，相反，miR-438-5p可能具有逆轉 TGF-β介導的肺上皮細胞和成纖維細胞增殖的作用[19]。同樣有趣的是，miR-21過表達亦可促進氣道平滑肌細胞(ASM)增殖與遷移，加速病情進展，而MiR-138可抑制ASM細胞增殖與遷移，緩解病情進展[17]。所以，miRNAs即可作為疾病發生發展的始動者，又可作為抑制其發生發展的保護者，在疾病的診治和預防方面值得我們進行更深一步的探索。

圖1 miRNAs表達譜在慢阻肺各病理生理過程中的差異性表達。長期煙霧刺激導致支氣管異常炎癥反應，持續的炎癥刺激及組織異常修復可導致小氣道狹窄及氣流受限，最終形成肺氣腫，當細菌或病毒入侵時可誘發慢阻肺急性加重。

四、miRNAs與肺氣腫

肺氣腫主要以肺泡組織的破壞、丟失以及肺泡彈性回縮力的降低為病理表現。目前對其 發病機制還不明確，大多學者認為其發生發展與機體蛋白酶-抗蛋白酶失衡關系密切，且目前研究發現，miRNA的異常表達與肺氣腫的嚴重程度密切相關。

一項 Spiral與 H合作的研究顯示，有63種 miRNAs的異常表達與肺氣腫嚴重程度相關， 其中 miR-638,miR-30c、miR181d被認為是最具相關性的靶基因。另一項探討miRNAs在 慢阻肺患者肺氣腫性肺破壞的特殊作用的研究指出，miR-638可促進肺氣腫肺組織和肺纖維瘤的成熟，進一步研究也證實，miR-638具有至少 50個靶點參與肺氣腫的調控[20]。miR-34可抑制 慢阻肺患者CD80和 CD86的表達及干擾素-α(INF-α)的分泌，從而影響SERPMΕ1蛋白酶抑制劑的表達，參與機體蛋白酶-抗蛋白酶失衡，影響肺氣腫的嚴重程度[21]。miR-452被發現其表達與其預測靶點基質金屬蛋白酶(MMP)-12的表達呈負相關，而(MMP)-12被認為是肺氣腫發生發展的重要機制之一，由此可知 miR-452與肺氣腫嚴重程度密切相關[22]。

此外，慢阻肺患者長期存在缺氧現象，導致體內氧化應激反應增強，P53表達上調，進而導致 miR-199上調，抑制缺氧誘導因子-α(HIF-α)表達，血管內皮生長因子(VEGE)生成減少，從而導致肺的持續性損害[2]。Ezzie ME等證實 miR-15b可通過抑制 TGF-β1下調重度肺氣腫患者中成纖維細胞蛋白多糖的表達而抑制肺氣腫的發展[23]。以上結果提示 miRNAs或許可作為減緩肺氣腫發生發展的切入點，為我們臨床治療提供新的方向。

五、miRNAs與慢性阻塞性肺疾病急性加重 (AECOPD)

對于慢性阻塞性肺疾病患者來說，急性加重是導致患者病情惡化甚至死亡的主要原因之一，遺憾的是，到目前為止，我們還沒有有效預防性阻塞性肺疾病急性加重的方法，目前主要的治療藥物僅有支氣管擴張藥、糖皮質激素及抗生素等，患者預后往往不良。目前的研究發現， miRNAs在慢性阻塞性肺疾病急性加重過程中扮演著重要角色，有望成為慢性阻塞性肺疾病急性加重的生物標志物。

慢性阻塞性肺疾病急性加重期，患者主要表現為呼吸困難明顯加重，痰量多且為膿性， 長期反復加重導致患者呼吸肌代償減弱，最終導致呼吸衰竭，甚至需呼吸肌輔助通氣治療。 目前骨骼肌耗竭已被用作慢性阻塞性肺病患者死亡率的預測指標。有研究發現，全身炎癥因子，如 TNF-α、IL-6、IL-8 等表達增多可能抑制骨骼肌的收縮及蛋白的降解，從而導致骨骼肌衰竭。此外，核蛋白(NCL)也與肌肉功能相關，研究發現，在性阻塞性肺疾病急性加重患者體內，miR-1及 miR-206也能通過對NCL的調控而導致骨骼肌功能障礙[24]。

Wnt 信號通路被認為是介導慢阻肺發展的重要靶點，其缺失可引起肺發育不全和T輔助細胞(Th)所誘導的肺出血。研究顯示，miR-15a、miR-16 在慢性阻塞性肺疾病急性加重患者中過表達，而 miR-15a、 miR-16可抑制 Wnt信號通路的表達，從而影響肺的發育與損害。此外，miR-146在急性期慢阻肺患者中與IL-1β、LTB4呈負相關，而在穩定期慢阻肺中僅與TNF-α呈負相關[25-26]。因此， miR-146 可作為預測穩定期慢阻肺和 性阻塞性肺疾病急性加重的生物標志物。

miR-125b是一種由低氧調節的miRNA,早期研究即表明，miR-125a與系統性紅斑狼瘡(SLE)炎癥趨化因子途徑有關。目前研究發現 miR-125b可通過調節氣道上皮細胞的凋亡而引起肺組織的損傷，也可以抑制巨噬細胞的經典活化，抵抗炎癥反應，同時又可促進巨噬細胞的活化，幫助炎癥擴散，進而導致阻塞性肺疾病急性加重。研究證實，miR-125b在慢性阻塞性肺疾病急性加重患者血清中的表達水平明顯高于穩定期慢阻肺患者與健康對照者，而在穩定期慢阻肺患者與健康對照組之間則未見明顯差異。為進一步了解其差異，一組關于miR125b在慢性阻塞性肺疾病急性加重患者治療前后的比較中發現，miR-125b表達水平在慢性阻塞性肺疾病急性加重患者治療后的第 7 天、第 14 天、第 28 天呈逐漸下降趨勢，且與穩定期慢阻肺患者相比，慢性阻塞性肺疾病急性加重患者血清 TNF-α、IL-6、IL-1β和 LTB4 水平明顯升高[27-28]，由此可知，miR-125b可能是一種促炎因子，可作為一種新的診斷AECOPD的有前景的生物標志物。

結 語

慢阻肺是現代醫學面臨的一項巨大的挑戰，無論從其高發病率或是高致殘率角度考慮， 都迫切需要尋找一種新方法、新手段來提供更好的預防與診療策略。目前諸多研究表明，多種 miRNA 參與了慢阻肺的炎癥反應、氣道重塑、肺氣腫嚴重程度及其急性加重過程，故而猜測 miRNAs 或許可作為新一代治療靶向藥物，在慢阻肺預防、臨床癥狀緩解或者逆轉疾病進展等方面發揮作用。

依據當前對表觀遺傳學的研究發現，miRNAs與表觀遺傳機制之間存在復雜的相互作用。一方面，miRNA的時空表達受到表觀遺傳機制的嚴格控制，如啟動子區域的DNA甲基化或組蛋白去乙酰化；另一方面，mirRNAs還可通過調節表觀遺傳機制的單個組分的表達如組蛋白去乙酰化酶或DNA甲基轉移酶來影響表觀遺傳機制，并且兩者間復雜的相互作用都參與了人類不同疾病的發生發展。所以，未來的研究應該解決miRNAs和表觀遺傳機制之間復雜的相互作用，畢竟每一個miRNAs都身處于一個龐大的調節網絡之中。