基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)解析海馬“壯陽、益精”功效的物質(zhì)基礎(chǔ)、潛在靶點與分子機制※

●萬慧琪 李知瑾 許光輝，▲ 鄭樂云 林金波

海馬（Haima，拉丁學(xué)名:hippocampus）為脊索動物門硬骨魚綱海龍科海馬屬動物，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，素有“南方人參”的美譽[1]；味甘、咸，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有溫腎壯陽、益精種子、止咳平喘、活血通脈、散結(jié)消腫之效，主治腎陽不足所致諸證[2]。藥理研究證實，海馬具有性激素樣作用、抗疲勞、抗氧化、提高機體免疫力、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜安神等藥理活性[3]。

近年來，隨著我國海馬養(yǎng)殖技術(shù)的日漸成熟，我國福建、廣東等沿海部分地區(qū)已實現(xiàn)了海馬的規(guī)模化養(yǎng)殖[4]。海馬的工廠化養(yǎng)殖，解決了長期以來藥用海馬基原不清、質(zhì)量難控等難點，推動了海馬的進一步開發(fā)利用。本研究針對目前海馬“壯陽、益精”功效的藥物應(yīng)用熱點[5]，采用網(wǎng)絡(luò)藥理研究方法，篩選海馬的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用靶點，明確海馬發(fā)揮壯陽、益精功效的分子機制，為海馬的深度開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫與軟件中國知網(wǎng)（https://www.cnki.net/）；Medline數(shù)據(jù)庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）；Bubchem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）；STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）；DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）；RCSB BDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）；Cytoscape v3.8.0 分析軟件（https://cytoscape.org/）。

1.2 海馬主要化學(xué)成分與“壯陽、益精”功效相關(guān)疾病靶點數(shù)據(jù)集構(gòu)建以CNKI、Medline 等數(shù)據(jù)庫及相關(guān)學(xué)術(shù)資料為主要數(shù)據(jù)來源[6-9]，對《中華人民共和國藥典》[10]所收錄的5 種海馬的主要化學(xué)成分及其含量進行收集、歸類，取化學(xué)成分合集建立海馬化學(xué)總成分集；根據(jù)化合物的含量、口服吸收利用度和靶點數(shù)目等指標(biāo)，組成本研究所需的海馬主要功效成分集。

現(xiàn)代藥理研究表明，海馬補腎壯陽功效主要體現(xiàn)在改善勃起功能障礙（ED）和弱精癥（AS）兩個方面[11-12]。本研究通過Gene card 數(shù)據(jù)庫獲取ED 和AS對應(yīng)靶標(biāo)，構(gòu)建中藥海馬“壯陽、益精”功效相關(guān)的疾病靶點數(shù)據(jù)集。

1.3 海馬“壯陽、益精”功效潛在靶點篩選利用在線軟件Venny2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)獲取海馬主要功效成分集與ED、AS疾病靶點數(shù)據(jù)集的交集數(shù)據(jù)，并繪制相應(yīng)的韋恩圖。

1.4 “藥物-疾病共有靶點”相互作用分析應(yīng)用在線STRING 平臺（https://string-db.org/），分別對海馬“壯陽、益精”功效潛在靶點進行相互作用關(guān)系分析。應(yīng)用Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建靶點蛋白交互網(wǎng)絡(luò)圖（BBI），計算相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，以度值大于中數(shù)的節(jié)點為核心節(jié)點。

1.5 核心靶點的基因本體（GO）與信號通路(KEGG)富集分析將篩選的核心靶點上傳至DAVID 6.8 在線數(shù)據(jù)分析平臺（https://david.ncifcrf.gov/）進行GO 和KEEG 富集分析，以P<0.01 為顯著差異篩選海馬“壯陽、益精”功效潛在靶點涉及的生物過程和信號通路，分析其分子機制。

2 結(jié)果

2.1 海馬“壯陽、益精”功效成分篩選現(xiàn)有文獻檢索結(jié)果表明，5種海馬共有的化學(xué)成分以氨基酸、脂肪酸、甾體和磷脂等化合物為主，其中水解氨基酸平均含量高達海馬干重的64.2%[13]，其次是脂肪酸，約占海馬干重的2.9%～4.8%，甾體類約占海馬干重的0.33%～0.78%[14]。根據(jù)成分含量、口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）及參與調(diào)節(jié)相關(guān)基因的數(shù)目（Number of related genes）等指標(biāo)綜合篩選，納入氨基酸21 種、脂肪酸14 種、甾體類7 種和磷脂5 種等4 大類化合物進行網(wǎng)絡(luò)藥理分析。見表1。

表1 海馬主要化學(xué)成分

2.2 海馬“壯陽、益精”功效潛在靶點篩選通過檢索Gene card 數(shù)據(jù)庫，獲得海馬中47 種主要成分對應(yīng)5764 個相關(guān)靶點，分別與1000 個ED 對應(yīng)靶標(biāo)和145個AS 對應(yīng)靶點取交集，得到海馬-ED 潛在靶點（Haima-ED）590個、海馬-AS潛在靶點（Haima-AS）54個。見圖1。

2.3 海馬“壯陽、益精”功效靶點PPI分別將篩選到的海馬“壯陽、益精”功效靶蛋白上傳至String 平臺進行網(wǎng)絡(luò)互作分析。BBI結(jié)果表明，海馬“壯陽”功效BBI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點576 個，平均度值為40.2，11567 條邊，中心介數(shù)0.454，P<1.0E-16；以度值高于平均值、介數(shù)低于平均值為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到核心靶標(biāo)218 個。海馬“益精”功效BBI 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點54 個，平均度值為3.7，100 條邊，中心介數(shù)0.56，P<1.0E-16；以度值高于平均值、介數(shù)低于平均值為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到核心靶標(biāo)19 個。見圖2。

圖1 海馬主要化學(xué)成分對應(yīng)靶基因與ED、AS相關(guān)基因交互情況

圖2 海馬“壯陽、益精”功效靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 海馬“壯陽、益精”功效核心靶標(biāo)GO 富集分析結(jié)果海馬“壯陽”功效核心藥效靶點，共富集59 個生物過程（BB），涉及52 個細胞組分和48 個分子功能（MF），見圖3；海馬“益精”功效核心藥效靶點，共富集12個生物過程，涉及7種細胞組分和4種分子功能，見圖4。

圖3 海馬“壯陽”功效核心靶標(biāo)GO富集分析圖

圖4 海馬“益精”功效核心靶標(biāo)GO富集分析圖

2.5 海馬“壯陽、益精”功效核心靶標(biāo)KEGG 信號通路富集分析結(jié)果應(yīng)用DAVID 6.8 生物信息在線分析平臺，分別對海馬的218個“壯陽”功效核心靶點和54個“益精”功效核心靶點進行KEGG通路富集分析。根據(jù)P<0.01 和FDR<0.01 對88 條海馬“壯陽”功效通路和6條海馬“益精”功效的主要通路進行富集篩選，結(jié)果表明:（1）海馬“壯陽”功效核心通路39 條，對應(yīng)四類主要功效成分，共有核心靶點基因133 個，包括氨基酸類成分對應(yīng)靶標(biāo)123個，脂肪酸類成分對應(yīng)靶標(biāo)81個，甾體類成分對應(yīng)靶標(biāo)74個，磷脂等成分對應(yīng)靶標(biāo)95個。其中，排名前5的信號通路對應(yīng)的核心靶點最多，分別為癌癥發(fā)生信號通路（pathways in cancer）、磷脂酰肌醇3激酶信號通路（BI3K-AKT）、神經(jīng)內(nèi)分泌及神經(jīng)信號傳遞（Neuroactive ligandreceptor interaction）、細胞因子相互作用（Cytokinecytokine receptor interaction）和Rap1 信號通路（Rap1 signaling pathway）。（2）海馬“益精”功效核心通路2條，對應(yīng)四類主要功效成分，共有核心靶點基因7個，包括氨基酸類成分對應(yīng)靶標(biāo)7個，脂肪酸類成分對應(yīng)靶標(biāo)3個，甾體類成分對應(yīng)靶標(biāo)6個，磷脂等成分對應(yīng)靶標(biāo)2個。其中，涉及的核心通路分別為青春晚期糖尿病（Maturity onset diabetes of the young）和2 型糖尿病（Type II diabetes mellitus）。見圖5。

2.6 海馬“壯陽”“益精”功效的主要成分及參與的核心通路共有35種主要化學(xué)成分協(xié)同發(fā)揮了“壯陽”功效的藥理作用，主要成分包括14種氨基酸、10種脂肪酸、7種甾體和4種磷脂。其中,有12種核心功效成分參與10個以上靶基因的調(diào)節(jié)，分別為絲氨酸、酪氨酸、丙氨酸、精氨酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、膽固醇、磷脂酰膽堿、神經(jīng)鞘磷脂、溶血磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺。共有22種主要化學(xué)成分協(xié)同發(fā)揮了“益精”功效的藥理作用，主要成分包括9種氨基酸、5種脂肪酸、4種甾體和4種磷脂，分別為亮氨酸、絲氨酸、酪氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、纈氨酸、組氨酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、十八碳二烯酸、十四烷酸、膽固醇、膽甾-4-烯-3-酮、3β-羥基-膽甾-5烯-7-酮、膽甾-5-烯-3β、7α-二醇、磷脂酰膽堿、神經(jīng)鞘磷脂、溶血磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺。

圖5 海馬“壯陽、益精”功效核心靶標(biāo)KEGG通路圖

3 討論

海馬在我國及東南亞各國藥用歷史悠久，其“補腎壯陽”的功效廣泛被認可，歷版《中華人民共和國藥典》均收載了海馬“溫腎壯陽”的功能主治[15-16]。本研究對《中華人民共和國藥典》2020 版所收錄的5 種海馬的47 種共有主要化學(xué)成分納入研究，主要有氨基酸、脂肪酸、甾體和磷脂等4大類成分，其中氨基酸類成分數(shù)量及含量占比最高，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果表明氨基酸、脂肪酸、甾體和磷脂等4類成分均為海馬“壯陽、益精”功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

研究表明，在治療勃起功能障礙方面，海馬粉末可顯著提高大鼠的性交能力和性功能，海馬壯陽膠囊也可以增強大鼠的交配能力[17-18]。在治療弱精方面，海馬乙酸乙酯提取物具有減輕良性前列腺增生癥狀并逆轉(zhuǎn)弱精癥[19]。從文獻查閱中可知，在海馬壯陽、益精藥理作用上，主要的有效部分是海馬粉末和粗提物。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)成分含量、口服生物利用度、類藥性及參與調(diào)節(jié)相關(guān)基因的數(shù)目等指標(biāo)綜合篩選出的21 種氨基酸類化合物、14種脂肪酸類化合物、7 種甾體類化合物和5 種磷脂類化合物具有壯陽、益精的作用，這為海馬壯陽、益精藥理作用提供了有效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

氨基酸在機體的含氮代謝、蛋白質(zhì)合成和更新中占重要地位，并參與激素、酶、維生素和其他生物活性物質(zhì)的合成。氨基酸的不足不僅導(dǎo)致精子生成障礙，而且嚴重影響精子的抗原活性。游離氨基酸參與活動精子的細胞代謝，是能量補充源，可以促進其活性，降低毒素的有害作用；必需氨基酸是合成核酸的重要原材料，補充必需氨基酸將改善機體合成核酸的能力，從而促進生精能力[20]。其中，酪氨酸參與調(diào)節(jié)激素水平和細胞代謝過程；精氨酸最顯著的特點是產(chǎn)生NO以維持機體氮平衡，與動物的繁殖性能有關(guān)；天冬氨酸鹽是機體氮的來源之一；賴氨酸可調(diào)節(jié)NO 的合成；甘氨酸作為核酸的組成成分之一，與精子的質(zhì)量和數(shù)量有關(guān)[21]。據(jù)報道，口服補充L-精氨酸可顯著增加大鼠陰莖組織NO水平和NOS活性[22]。彭建平等人通過給大鼠口服高劑量L-瓜氨酸8周，顯著增強了大鼠陰莖的勃起功能[23]。研究表明，嚴重ED 患者血清L-精氨酸水平明顯低于輕度ED 患者[24]；體外L-精氨酸孵育可改善老齡大鼠海綿體對乙酰膽堿刺激的舒張反應(yīng)[25]；口服L-精氨酸可改善男性不育患者的精子質(zhì)量和勃起功能[20]。此外，氨基酸復(fù)配維生素能夠提高精子質(zhì)量[26-28]。本世紀初，我國研制出了主要由精氨酸氨和硫酸鋅組成的復(fù)方氨基酸，臨床試驗結(jié)果顯示其對AS有一定的療效[29]，進一步證實了氨基酸類成分的“壯陽、益精”功效。除氨基酸類成分外，脂肪酸、甾體及磷脂等成分在治療ED 和AS 方面也發(fā)揮了重要的作用。磷脂是動物和人體細胞膜的重要組成部分，具有強精益腎，提高機體免疫功能，保肝補血等作用，還與機體的生殖生理和激素的代謝密切相關(guān)[30]。脂肪酸和膽固醇是各種生物膜的重要組成部分，它們的缺失會致使精子受損[31]，其中，二十二碳六烯酸是前列腺及精子的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[32]。日本學(xué)者曾報道海馬乙醇提取物能使雄鼠前列腺、精囊、提肛肌的重量明顯增加，具有雄激素樣作用[32]，證實了脂肪酸、甾體、磷脂等成分改善ED和AS的藥理作用。

綜上，本研究對海馬“壯陽、益精”的功效物質(zhì)基礎(chǔ)、潛在靶點和分子機制進行了初步解析，并為海馬的現(xiàn)代藥理的進一步研究指明了方向。