GLP-1對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂肪變性的影響

李丹丹，劉揚，韓家凱，高威，于彤，龐嫵燕

(河南大學淮河醫院 內分泌科，河南 開封 475000)

隨著人口老齡化、酒精濫用、肥胖癥在全球流行趨勢逐日加重，脂肪性肝病已逐漸替代病毒性肝炎成為終末期肝病的重要病因。非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)根據疾病進展的不同階段分為非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性肝纖維化和肝硬化[1]。肝臟脂肪變性是NAFLD的早期階段，若不加干預，可進展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化，甚至誘發肝細胞癌[2]。NAFLD發病機制目前認為主要是脂肪組織的胰島素抵抗，誘發氧化應激及炎癥反應，進而導致組織損傷[3]，因此也被認為是代謝綜合征的一部分[4]。胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)由腸道L細胞分泌，是目前已知作用最強的腸促胰島素分泌肽。動物和人體實驗均發現GLP-1能夠顯著改善脂肪細胞的胰島素敏感性，且在降低血糖同時改善血脂代謝。本課題從動物實驗入手，研究和分析GLP-1對NAFLD的治療效果。

1 資料與方法

1.1 實驗動物雄性約4周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠150只，體質量為(140±10)g，購自河南大學實驗動物中心。在適應性喂養2周后隨機分為空白對照組(control group，CON組)，模型對照組(high-fat diet，HFD組)和GLP-1低、中、高劑量治療組(GLP-1 low、middle、high dose，GLD組、GMD組、GHD組)，每組30只。每天12 h燈光照射，室內溫度控制23～25 ℃，濕度40%～50%。對所有動物的飼養及實驗處理均遵照河南大學實驗動物倫理委員會的章程及規定執行。

1.2 動物模型的建立及分組對CON組全程喂食普通飼料，給予HFD組與GLP-1組高脂溶液(普通飼料88%、豬油10%、膽固醇2%)灌胃12周，促使NAFLD模型的形成。造模成功后，分別給予GLD組、GMD組、GHD組GLP-1(丹麥諾和諾德公司)0.1、0.2、0.4 mg·kg-1·d-1。

1.3 標本的采集及處理每周準確稱大鼠體質量，分別于治療第4周和第8周禁食12 h后予水合氯醛麻醉后用注射器心臟尖端取血，離心后取上清液，凍存于-80 ℃冰箱內。計算治療前后各組大鼠體質量變化情況及肝指數(肝重占總體質量的百分比)。

1.4 血和肝臟生物化學指標的測定監測CON組和HFD、GLD、GMD、GHD組大鼠血清膽紅素、蛋白、肝功能、血脂、空腹血漿葡萄糖(fasting blood glucose，FBG)、空腹胰島素(fasting insulin，FINS)等變化情況。測定總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、總膽固醇(total chloesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholestero，LDL-C)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholestero，HDL-C)、FBG的方法為氧化酶法，檢測FINS、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)、間接膽紅素(indirect bilirubin，IBIL)、谷草轉氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase，AST)、谷丙轉氨酶(glutamate transaminase，ALT)的方法為酶聯免疫法。由公式(FBG×FINS/22.5)計算胰島素抵抗指數(Homa insulin resistance index，HOMA-IR)。每只大鼠取相同部位肝組織50 mg，應用氯仿/甲醇制備肝組織勻漿并提取脂質，采用GPO-PAP法測定肝臟TC、TG水平。

2 結果

2.1 一般情況干預過程中CON組活動度好，飲食正常，皮毛整潔。HFD組活動減少，飲食增多，毛發凌亂黃膩。GLP-1干預組大鼠的一般情況與CON組相似。

2.2 大鼠體質量和肝指數治療開始時各組大鼠體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；治療8周后GLD組與HFD組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；GMD組、GHD組與HFD組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。與CON組相比，HFD組肝指數明顯升高。治療4周后GLD、GMD、GHD組較HFD組有一定的改善，但除GHD組外，其他3組差異無統計學意義(P>0.05)；治療8周后3個治療組相較于HFD組降低(P<0.05)。見表1。

2.3 血清學代謝指標治療4周后，GLD、GMD、GHD組DBIL、IBIL以及CHO、TG、LDL-C、AST、ALT相較于HFD組下降，差異有統計學意義(P<0.05)，治療8周后下降更明顯(P<0.05)；治療4、8周后GLD、GMD、GHD組HDL-C、TP、ALB較HFD組升高，差異有統計學意義(P<0.05)。GLD、GMD、GHD 3組間比較，GHD組較GLD組變化更明顯(P<0.05)。見表2、3。

表1 各組大鼠處死時體質量及肝指數比較

注：與HFD組比較，aP<0.05。

表2 治療4周后各組大鼠血清學指標比較

注：與HFD組比較，aP<0.05；與GLD組比較，bP<0.05；DBIL—直接膽紅素；IBIL—間接膽紅素；TC—總膽固醇；TG—甘油三酯；LDL-C—低密度脂蛋白；HDL-C—高密度脂蛋白；AST—谷草轉氨酶；ALT—谷丙轉氨酶；TP—總蛋白；ALB—白蛋白。

表3 治療8周后各組大鼠血清學指標比較

注：與HFD組比較，aP<0.05；與GLD組比較，bP<0.05；DBIL—直接膽紅素；IBIL—間接膽紅素；TC—總膽固醇；TG—甘油三酯；LDL-C—低密度脂蛋白；HDL-C—高密度脂蛋白；AST—谷草轉氨酶；ALT—谷丙轉氨酶；TP—總蛋白；ALB—白蛋白。

2.4 肝臟氧化和抗氧化能力高脂飲食后HFD組NAFLD大鼠模型肝勻漿丙二醛(malondialdehyde，MDA)明顯升高，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)明顯降低。治療4周后，GLD、GMD、GHD與HFD組相比，各指標差異有統計學意義(P<0.05)。治療8周后，各項指標進一步接近于CON組，與HFD組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；GHD組變化更明顯，且與GLD組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 治療4、8周后各組大鼠肝臟氧化和抗氧化能力比較

注：與CON組比較，aP<0.05；與治療4周后HFD組比較，bP<0.05；與治療8周后HFD組比較，cP<0.05；與治療8周后GLD組比較，dP<0.05；GSH—谷胱甘肽；SOD—超氧化物歧化酶；MDA—丙二醛。

2.5 HOMA-IR高脂飲食后HFD組NAFLD大鼠HOMA-IR明顯升高，治療4周后，GLD、GMD、GHD組與HFD組相比改善明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。3個治療組呈現出逐步降低的趨勢，GHD組降低最明顯，與GLD組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。治療8周后，改善趨勢與治療4周后一致，但較治療4周后有進一步的降低。見表5。

表5 治療4、8周后各組大鼠HOMA-IR比較

注：與HFD組比較，aP<0.05；HOMA-IR—胰島素抵抗指數。

3 討論

在大多數發達國家中，NAFLD已經成為一種最為常見的肝病。肝臟在糖脂代謝中起關鍵作用，因此，NAFLD是許多代謝性疾病的風險因素，如2型糖尿病、高脂血癥、高胰島素血癥及動脈粥樣硬化等。目前，NAFLD和2型糖尿病已經成為嚴重的全球公共衛生問題[5]。NAFLD在普通成年人中的發生率為10%～24%，在肥胖和2型糖尿病人群中發病率高達58%～74%和49%～62%。NASH患者2型糖尿病的發病率超過50%[6]。糖尿病是一個強大且獨立的NAFLD危險因素，二者互為條件加速惡化，有致死的風險[7]。另外非酒精性肝炎可通過釋放炎性介質、血栓形成物及促氧化物質以及通過NAFLD對胰島素抵抗及動脈粥樣硬化的促進作用，促進心腦血管并發癥的發生。越來越多的證據表明，NAFLD的臨床負擔并不局限于肝臟相關疾病，大多數NAFLD患者的首要死亡原因是心血管疾病[7]。

關于NAFLD的具體發病機制尚不明確，以前主要觀點是“二次打擊”假說[2,8]：代謝失衡和氧化應激。目前，“雙重打擊”學說替代“二次打擊”學說成為一種更加科學的解釋[9-10]：多種因素共同作用于易感個體最終導致NAFLD的發生。這些因素包括胰島素抵抗、脂肪組織分泌的激素、營養因子、腸道微生物群以及遺傳和表觀遺傳因子，其共同作用會改變肝細胞脂肪含量并影響肝臟炎癥環境，從而通過異質性肝細胞損傷途徑導致慢性肝臟炎癥的發生，并可能發展為肝細胞壞死，肝星狀細胞的活化和纖維基質的沉積。胰島素抵抗是NAFLD的一個基本特征，也是促進該病進展的重要機制。研究證實，胰島素抵抗與肝細胞內甘油三酯的異常積累緊密相關[11]。脂肪酸主要來源于脂肪組織內的脂肪分解、飲食攝入和從頭合成，在肝臟中，游離脂肪酸可以重新酯化為甘油三酯，進行β-氧化或作為極低密度脂蛋白排泄，胰島素抵抗會使胰島素抑制肝糖輸出的能力下降，導致游離脂肪酸向肝臟的通量增加以及甘油三酯的產生增加，從而形成NAFLD。在高胰島素血癥中，SREBP-1c的上調導致糖異生基因的過度表達，導致脂質積聚到肝臟中，從而形成NAFLD。鑒于此，NAFLD防治指南(2018更新版)提出：鑒于NAFLD是肥胖和代謝綜合征累及肝臟的表現，大多數患者肝組織學改變處于單純性脂肪肝階段，治療NAFLD的首要目標為減肥和改善胰島素抵抗，預防和治療代謝綜合征、2型糖尿病及其相關并發癥，從而減輕疾病負擔，改善患者的生活質量并延長壽命[12]。

GLP-1作為一種葡萄糖依賴性的腸促胰素，食物刺激后由小腸L細胞分泌入血，主要作用于胰腺β細胞，葡萄糖依賴性地刺激胰島素分泌，抑制α細胞分泌胰高血糖素，抑制食欲以及胃排空，促進胰島β細胞增殖，抑制其凋亡[13-14]。還有研究顯示，GLP-1上調脂肪細胞表面胰島素受體及胞內胰島素底物的數量，促進葡萄糖轉運子4的表達，進而改善由腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)介導的胰島素抵抗。另外，GLP-1能夠通過降低脂肪細胞內巨噬細胞的浸潤，直接抑制炎癥信號通路，從而改善胰島素抵抗，進而對NAFLD起到明顯的改善作用[15]。本實驗通過高脂飼料喂養SD大鼠成功建立NAFLD模型，HFD組肝臟質量與大鼠體質量百分比第8周時高達(3.11±0.52)%，超過CON組的(2.38±0.24)%。這表明脂肪顆粒已經大量附著在肝細胞。該模型具有NAFLD的典型病理特征，如肝細胞腫脹，體積增大，廣泛的大細胞性脂肪變性，胞質內大小不等的脂滴空泡，匯管區有炎癥細胞浸潤。血清學指標ALT、AST、TBIL、DBIL顯著增高。另外，高脂飲食導致肝臟脂質代謝發生障礙，血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，TP和ALB水平升高。GLP-1干預治療后，大鼠肝臟的脂肪變性得以改善，肝臟所占大鼠體質量百分比與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。這表明GLP-1可明顯減少NAFLD肝臟中沉積的脂肪顆粒，起到保護肝臟的作用。大鼠體質量、肝指數及上述血清學指標均有顯著改善，這提示GLP-1能顯著改善NAFLD脂質代謝紊亂。

氧化應激、脂質過氧化和炎癥反應是NAFLD發病中的又一次打擊。發生NAFLD時，肝細胞中過剩的游離脂肪酸發生脂質過氧化，產生大量的活性氧簇，一方面促使TNF-α生成，抑制線粒體呼吸，誘發并加重胰島素抵抗；另一方面活化轉化生長因子-β1、轉錄因子等多種細胞因子，進一步加重肝脂肪變性、壞死及纖維組織生成。MDA是自由基作用于脂質發生過氧化反應的氧化終產物，MDA的量可間接反映細胞損傷的程度。SOD是生物體內重要的抗氧化酶，是生物體內清除自由基的首要物質。GSH結構中含有一個活潑的巰基，易被氧化脫氫[16]。本實驗也顯示，在NAFLD大鼠模型的血漿中，氧化因子MDA升高，抗氧化指標(SOD、GSH)降低(P<0.05)。GLP-1治療8周后，上述指標明顯改善。這提示在NAFLD中，GLP-1可通過減輕炎癥反應和提高抗氧化能力改善肝功能。

綜上所述，GLP-1可以改善NAFLD大鼠肝功能，降低肝臟脂肪含量，改善肝臟抗氧化能力和胰島素抵抗，對NAFLD有治療作用。