當歸藤補血有效部位的篩選及其補血機制研究

劉玟君 闕祖亮 李金洲 陳子雋 黃周艷 龐丹清 陳良妮 陳勇

中圖分類號 R285

文獻標志碼A

文章編號1001-0408（2020）03-0293-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.03.08

摘要 目的：考察當歸藤不同提取部位對血虛模型小鼠的補血作用，并探索其作用機制。方法：將70只小鼠隨機分為空白對照組（水）、模型對照組（水）、陽性對照組（當歸補血口服液，324g/kg）和當歸藤石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位組（給藥劑量依次為4.2、10.64、22.07、5.0g/kg，以提取部位浸膏計），每組10只。小鼠均灌胃給藥，每天1次，連續給藥14d。除空白對照組外，其余各組小鼠均于開始給藥的第12、13天時腹腔注射環磷酰胺（80mg/kg）復制血虛模型。末次給藥30min后，采用全自動血細胞分析儀檢測小鼠外周血象指標[白細胞計數（WBC）、紅細胞計數（RBC）、紅細胞壓積（HCT）、血小板計數（PLT）和血紅蛋白濃度（HGB）]水平;采用酶聯免疫吸附法測定小鼠血清中自細胞介素2（IL-2）、IL-3、IL-6、促紅細胞生成素（EPO）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、血管細胞黏附分子1（VCAM-1）水平;計算小鼠胸腺指數與脾指數。結果：與空白對照組比較，模型對照組小鼠各血象指標水平、血清中IL-2、IL-3、IL-6、EPO、G-CSF、M-CSF、VCAM-1水平以及胸腺指數均顯著降低，脾指數顯著升高（P<0.01）。與模型對照組比較，當歸藤石油醚部位組小鼠上述指標差異均無統計學意義（P>0.05）;當歸藤乙酸乙酯部位組小鼠外周血RBC、HGB、PLT水平、血清中IL-2、IL-6、G-CSF、M-CSF、VCAM-1水平以及胸腺指數顯著升高（P<0.05或P0.05）;除當歸藤水部位組小鼠WBC升高不顯著外，當歸藤正丁醇部位、水部位組小鼠上述各血象指標和血清因子水平及胸腺指數均顯著升高，脾指數均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結論：當歸藤乙酸乙酯、正丁醇和水部位均可提高血虛模型小鼠的免疫功能和造血因子的表達，具有一定的補血作用。

關鍵詞 當歸藤;補血作用;部位篩選;環磷酰胺;造血因子;免疫功能;小鼠

當歸藤為紫金牛科酸藤子屬植物小花酸藤子（Em-belia paryiflora Wall.exA.DC）的根與老藤，具有補血、調經、強腰膝的功效，主治貧血、月經不調、閉經、產后虛弱、腰腿酸痛、跌打損傷等癥，民間還用于治療不孕癥等，具有溫腎補血的作用[1]。本品為婦科良藥，是廣西壯族和瑤族民間常用藥，在廣西部分少數民族地區常作為當歸藥材使用，在中成藥桂龍藥膏與桂龍藥酒均有使用[2]。當歸藤中含有豐富的三萜皂苷類、糖類、酚類、鞣質類、黃酮類、揮發油等化學成分，目前分離出的化合物有正三十烷酸、正三十烷酸乙酯、a-菠甾醇、豆甾醇等，并且有學者發現其中含有沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素等物質，并對其進行了含量測定[3-6]。本課題組前期研究表明，當歸藤具有抗炎、鎮痛、抗凝血等藥理活性，且體外研究發現當歸藤紅色素和當歸藤多糖均有抗氧化作用[7-9]。但關于當歸藤補血作用的研究報道較少，故本研究擬通過腹腔注射環磷酰胺（CTX）復制血虛小鼠模型，篩選當歸藤補血的有效部位，并研究其對免疫因子和造血因子等指標的影響，探索當歸藤補血的作用機制，為其臨床應用及進一步開發利用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

XT-20001型希森美康全自動血液分析儀（上海涵飛醫療器械有限公司）;EL204型電子天平[梅特勒一托利多儀器（上海）有限公司];YN-80P型制冰機（杭州冰之純制冷設備有限公司）;500-BS-11型電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）;HH-S2型數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）;EnVisionXcite型全波長多功能酶標儀（美國Perkin Elmer公司）;DW-86L490型超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

當歸藤于2016年8月購于廣西靖西縣，經廣西中醫藥大學藥用植物教研室郭敏副教授鑒定為紫金牛科酸藤子屬植物當歸藤（E. parviflora Wall.exA.DC）的老藤;當歸補血口服液（鄭州市協和制藥廠，批號：011701142，規格：10mL）;注射用環磷酰胺（美國百特國際有限公司，批號：88214B，規格：0.2g）;白細胞介素2（IL-2）、IL-3、IL-6、促紅細胞生成素（EPO）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、血管細胞黏附分子1（VCAM-1）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國R&D公司，批號：20180901A，20180501A、20180602B、20180802B、2018040IA、2018- 0501A、20180302B），水為超純水。

1.3 動物

健康KM小鼠70只，SPF級，雌性，體質量（18±2）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002]。小鼠飼養于清潔級動物房內，控制室溫為25℃左右、濕度為65%左右，模擬自然光周期為12h光照、12h黑暗。采用標準嚙齒類動物飼料和超純水飼養，期間小鼠自由飲水和攝食。本實驗遵循廣西中醫藥大學動物實驗倫理要求。

2 方法

2.1 當歸藤不同提取部位的制備

當歸藤提取物：取當歸藤藥材2.3kg，用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，減壓回收溶劑，得乙醇提取物浸膏234g（得率為10.17%）。將乙醇提取物浸膏用水分散后，依次用石油醚（ 60--90℃）、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，分別得到石油醚部位浸膏13g（得率為0.565%）、乙酸乙酯部位浸膏33g（得率為1.435%）、正丁醇部位浸膏68.5g（得率為2.978%）和剩余水部位浸膏15.5g（得率為0.674%）。

2.2 分組、給藥與造模

將小鼠適應性飼養1周，然后按體質量隨機分為7組，即空白對照組、模型對照組、陽性對照組（當歸補血口服液）和當歸藤石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位組，每組10只。根據課題組前期研究[8]及預實驗結果確定當歸藤各提取部位的給藥劑量，即石油醚部位組為4.2g/kg、乙酸乙酯部位組為10.64g/kg、正丁醇部位組為22.07g/kg、水部位組為5.0g/kg（以上給藥劑量均以提取部位浸膏量計）;根據參考文獻[10]及預實驗結果確定陽性對照組（當歸補血口服液）的給劑量為324g/kg。各組小鼠均預防性灌胃給藥，灌胃體積為1mL/100g，每天1次，連續給藥14d。空白對照組和模型對照組小鼠同法灌胃等體積的超純水。在開始給藥的第12、13天，除空白對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射環磷酰胺（80mg/kg），連續2d，復制小鼠血虛模型[11]，造模期間仍繼續給藥;空白對照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。注射環磷酰胺后每天觀察并記錄小鼠的活動情況。

2.3 外周血象指標水平的檢測

末次給藥后30min，所有小鼠開始禁食不禁水12h，于眼眶靜脈取血，采用全自動血細胞分析儀進行血象指標[白細胞計數（WBC）、紅細胞計數（RBC）、紅細胞壓積（HCT）、血小板計數（PLT）和血紅蛋白濃度（HGB）]水平分析。隨后摘眼球取血用于后續檢測。

2.4 血清免疫和造血因子水平測定

摘眼球采血后，將血樣于室溫內靜置60min，4℃下以3000r/min離心15min，分裝血清，置于凍存管中，密封，-80℃凍存待檢。實驗時，取適量血清，測定其中免疫相關因子（IL-2、IL-6、IL-3）和造血相關因子（EPO、G-CSF、M-CSF、VCAM-1）水平，具體操作按照相應ELI-SA試劑盒說明書進行。

2.5 胸腺指數和脾指數測定

小鼠取血后處死，取胸腺、脾，稱質量，計算其胸腺指數和脾指數：胸腺指數=胸腺質量（g）/體質量（g），脾指數=脾質量（g）/體質量（g）。

2.6 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件處理實驗數據。計量資料以 ±s表示，多組間樣本比較采用方差分析，兩樣本均數比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠活動情況觀察結果

空白對照組小鼠的飲食情況正常，體質量呈增長趨勢，毛發有光澤，活動情況正常，未見其他異常情況;模型對照組小鼠進食量較少，體質量呈下降趨勢，皮毛暗淡無光澤，有脫毛現象，活動量少，目光呆滯等;各給藥組小鼠進食量正常，皮毛具有一定的色澤，活動情況較好。

3.2 小鼠外周血象指標水平測定結果

與空白對照組比較，模型對照組小鼠外周血中WBC、RBC、HCT、PLT、HGB水平顯著降低（P0.05）;當歸藤乙酸乙酯部位組小鼠外周血中RBC、PLT、HGB水平顯著升高（P<0.05或P

3.3 小鼠血清中免疫因子水平測定結果

與空白對照組比較，模型對照組小鼠血清中IL-2、IL-3、IL-6水平顯著降低（P<0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組和當歸藤正丁醇部位、水部位組小鼠血清中上述3個因子水平以及當歸藤乙酸乙酯部位組小鼠血清中IL-2、IL-6水平顯著升高（P<0.01），但當歸藤石油醚部位組小鼠血清中上述3個因子水平差異無統計學意義（P>0.05）。各組小鼠血清中IL一2、IL-3、IL-6水平測定結果見表2。

3.4 小鼠血清中造血因子水平測定結果

與空白對照組比較，模型對照組小鼠血清中EPO、G-CSF、M-CSF、VCAM-1水平顯著降低（P<0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組和當歸藤正丁醇部位、水部位組小鼠血清中上述4個因子水平以及當歸藤乙酸乙酯部位組小鼠血清中G-CSF、M-CSF、VCAM-1水平顯著升高（P<0.05或P0.05）。各組小鼠血清中EPO、G-CSF、M-CSF、VCAM-1水平測定結果見表3。

3.5 小鼠胸腺指數和脾指數測定結果

與空白對照組比較，模型對照組小鼠胸腺指數顯著降低（P<0.01），脾指數顯著升高（P<0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組和當歸藤正丁醇部位、水部位、乙酸乙酯部位組小鼠胸腺指數顯著升高（P<0.05或P<0.01）;陽性對照組和當歸藤正丁醇部位、水部位組小鼠脾指數顯著降低（P<0.05或P

4 討論

環磷酰胺可以破壞骨髓造血系統，使外周血細胞數量降低，影響骨髓造血干/祖細胞的增殖、分化、轉移.從而導致血虛，因此可以通過觀察外周血象判斷血虛動物模型是否成功建立，而血液中血細胞數量的變化可以反映藥物對血虛模型動物造血功能的影響[12]。當歸補血口服液在臨床上常用于治療氣血兩虛證，可以提高血虛模型小鼠的免疫功能及造血功能[13]，故本研究以其為陽性對照藥。本研究結果顯示，模型對照組小鼠外周血中RBC、HCT、HGB、PLT水平均顯著降低（P<0.01），說明腹腔注射環磷酰胺后小鼠血虛模型成功建立;而當歸藤乙酸乙酯部位、水部位及正丁醇部位對血虛模型小鼠外周血中RBC、HGB、HCT、WBC、PLT有明顯的提升效果，表明給藥后模型小鼠的骨髓造血功能得到了恢復，這也提示當歸藤乙酸乙酯部位、水部位及正丁醇部位對血虛模型小鼠的造血功能有一定的改善作用。

環磷酰胺具有較強的細胞毒性，因此其在復制小鼠血虛模型的同時可能造成嚴重的免疫抑制，當機體免疫功能下降時，會抑制造血干細胞增生，導致骨髓衰竭[14]。IL-2能夠誘導干擾素和多種細胞因子的分泌，是免疫調節的中心環節，有效促進T淋巴細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）的增生，促進B淋巴細胞分化并生成抗體[15]。IL-3是免疫系統調節造血系統的主要因子，主要作用于早，中期造血祖細胞的增殖和分化，從而阻止造血細胞的凋亡[16]。IL-6具有刺激活化B淋巴細胞增殖、促進抗體分泌、刺激T淋巴細胞增殖、促進血細胞發育等功效，對細胞免疫和體液免疫均有明顯的影響[17]。胸腺是機體內重要的免疫器官;脾是免疫器官，同時與造血功能密切相關，當骨髓造血功能受損時，脾可代償性地造血，致使脾體積擴大、質量增加[18]。因此，本研究將IL-2、IL-3、IL-6以及胸腺指數和脾指數作為觀察小鼠免疫功能的指標，進而考察當歸藤不同提取部位對小鼠免疫功能的影響。本研究結果顯示，血虛模型小鼠脾指數明顯升高，血清中IL-2、IL-3、IL-6水平明顯降低，表明模型小鼠免疫功能明顯受損。當歸藤不同提取部位給藥后，可不同程度地升高模型小鼠血清中IL-2、IL-6水平，升高其胸腺指數，降低其脾指數，這提示當歸藤不同提取部位能夠增強血虛模型小鼠的免疫功能，其中尤以當歸藤正丁醇部位和水部位作用最為明顯。

造血因子是促進骨髓造血細胞分化、增殖和定向成熟的一系列活性蛋白，可分為CSF和造血輔助因子，已發現的CSF有多功能集落刺激因子（Multi-CSF），如IL-3、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、Meg-CSF、EPO等[19].EPO是由腎皮質腎小管周圍間質細胞和肝分泌的一種激素樣物質，是一種人體內源性糖蛋白激素，可刺激紅細胞的增殖、分化和成熟，是紅細胞發育過程中最重要的調節因子，可增強造血功能[20-21]。VCAM-1能夠促進新血管形成，還能促進損傷組織修復進程，為缺血組織提供新的血液供應;G-CSF主要功能是刺激造血干細胞增殖分化，對多種成熟的細胞起促進作用[11]。因此，血清中EPO、G-CSF、M-CSF、VCAM-1水平的變化對反映造血功能的變化有重要意義。本研究結果顯示，當歸藤乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位給藥后，能夠不同程度地升高血虛模型小鼠血清中EPO、G-CSF、M-CSF、VCMA-1等造血因子的水平，說明以上部位提取物可通過調節與造血功能相關的細胞因子的水平發揮其補血作用。

綜上所述，當歸藤乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位均可提高血虛模型小鼠的免疫功能、造血因子的表達，具有一定的補血作用。

參考文獻

[1] 滕紅麗，梅之南，郭力城.壯醫風濕免疫病常用藤本藥物藥學及臨床應用研究[J]遼寧中醫雜志，2011，38（5）：873-875

[2]廣西壯族自治區衛生廳廣西中藥材標準[S]南寧：廣西科學技術出版社，1992：44

[3]龐丹清，闕祖亮，陳勇，等不同產地的壯藥當歸藤中4個成分含量的測定[J]遼寧中醫雜志，2019，46（9）：1919-1921

[4]闕祖亮，劉鼎，陳勇，等，當歸藤的化學成分研究[J].中國民族民間醫藥，2017，26（5）：5-9.

[5]盧森華，張龍，鄭錫任，等，當歸藤化學成分的預試驗研究[J]廣西中醫學院學報，2011，14（4）：42-44.

[6]龐丹清，陳勇，闕祖亮，等廣西民族藥當歸藤研究及展望[J]遼寧中醫藥大學學報，2019，21（4）：104-106

[7]管海波，黃忠京，銀小玲，等當歸藤紅色素穩定性研究[J]食品研究與開發，2012，33（10）：232-235

[8]魏中璇，劉鼎，陳勇，等，當歸藤抗炎、鎮痛及抗凝血有效部位的研究[J]中藥材，2015，38（11）：2376-2380

[9]龐丹清，闕祖亮，陳勇，等.響應面法優化當歸藤多糖提取工藝及抗氧化活性研究[J]時珍國醫國藥，2019，30（1）：22—25

[10]劉培建，苗明三，高漸聯熟地黃多糖對氣血雙虛小鼠全血細胞及血清粒一巨噬細胞集落刺激因子水平的影響[J]中國組織工程研究與臨床康復，2008，16（38）：7543-7546

[11]李朝政，楊海淼，張文卓，等參紅補血顆粒調控造血因子的作用研究[J].中國藥房，2014，25 （31）：2881-2883.

[12]馬盼盼，葉軍，楊艷芳，等.大鼠免疫抑制長期模型的建立及驗證[J]中國藥房，2018，29（15）：2045-2048

[13]方曉艷，程再興，苗明三，小鼠氣血雙虛模型的復制[J]中國醫藥導報，2008，5（35）：9-10

[14] 張毓文，謝曉恬環磷酰胺治療再生障礙性貧血[J]中國小兒血液與腫瘤雜志，2009，14（1）：45-47

[15]魏燕高，肖喜艷，巴云鵬變應性鼻炎患者血清IL-2、IL-4及IL-12含量及意義[J]河南醫學研究，2012，21（1）：88-89、92

[16]朱映黎，張建軍，王景霞，等芍藥內酯苷和芍藥苷對環磷酰胺致血虛小鼠的補血作用及對GM-CSF，IL-3，TNF-a影響的比較研究[J]中國中藥雜志，2015，40（2）：330-333

[17]劉顯東，毛海峰.白細胞介素-6的生物學功能及與運動的關系探討[J]宜春學院學報，2009，31（6）：166-168.

[18]馬清林，吳國泰，孫敏，等當歸補血作用研究進展[J]甘肅中醫藥大學學報，2019，36（3）：93-97

[19]JELKMANN W. Physiology and pharmacology of erythro-poietin[J]. Transfus Med Hemoth，2013，40（5）：302-309

[20]TIAN Y， XIANG Y， WAN G， et al Effects and mecha-nisms of Bazhen decoction， Siwu decoction， and Sijunzidecoction on 5-fluorouracil-induced anemia inmice[J].JTradit Chin Med，2016，36（4）：486-495

[21]BING SJ， CHO J， KIM A， et al.Geraniin promotes recov-ery of hematopoietic cells after radiation injury[J]. AmJChin Med，2017，45（5）：1003-1016.

（收稿日期：2019-10-09修回日期：2019-12-03）

（編輯：林靜）