紅肉蜜柚果實冷藏過程中的活性氧代謝

汪永紅，羅曉敏，劉順枝，胡位榮

(廣州大學 生命科學學院，廣東 廣州，510006)

1 材料與方法

1.1 材料

成熟紅肉蜜柚果實，廣東省梅州市商業性生產柚園。

1.2 儀器與設備

5810 R冷凍高速離心機,德國Eppendorf公司；UV-1800PC型紫外分光光度計,上海美譜達儀器有限公司；RXZ-430D型智能人工氣候培養箱，寧波東南儀器有限公司；SZ-93型自動雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；DW-86L388J型Haier醫用超低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司；WP-RO-208型沃特浦實驗室超純水機，四川沃特爾水處理設備有限公司；301P-01N型臺式pH計，美國Thermo orion公司。

1.3 方法

挑選大小一致、無病蟲害、無機械損傷的果實，立即運回實驗室，用施保功(咪鮮胺錳鹽，美國富美實公司)∶水(1∶1 500，質量比)溶液浸泡1 min滅菌，取出晾干，放置室溫預貯48 h，用保鮮膜包裝封口，隨機分成2組，分別置于人工氣候培養箱中，貯藏條件分別為室溫對照(25 ℃)和冷藏(8 ℃)[6-7]，相對濕度為80%～90%。果實貯藏90 d，每隔10 d分別取3個果實，分離外果皮、白皮層和汁胞3個部分，于赤道附近隨機混合取樣各1 g，將樣品置于-80 ℃超低溫冰箱中速凍備用。

1.3.1 MDA含量測定

參照JANNATIZADEH等[8]的方法并略加改進。取1 g樣品，加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)，手動勻漿，于4 ℃下10 000 r/min離心15 min。取1 mL上清液，加入3 mL 0.5% 硫代巴比妥酸(TBA)，反應30 min后，10 000 r/min離心15 min，取上清液分別測定532和600 nm的吸光值，重復3次取平均值，結果以μmol/g(FW)表示。

1.3.2 H2O2含量測定

參照SUN等[9]的方法，略有修改。取1 g樣品，加入預冷丙酮，勻漿，于4 ℃12 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL加入四氯化鈦-鹽酸溶液0.5 mL、濃氨水0.2 mL充分混合、反應10 min，收集沉淀，向沉淀中加入3 mL稀硫酸，待其完全溶解后，測定410 nm處反應液吸光值，重復3次取平均值，結果以mmol/g(FW)表示。

1.3.3 CAT、POD和SOD活性的測定

參照李玲[10]的方法。CAT活性的測定，在240 nm處測定吸光值，以每分鐘減少0.01為1個酶活力單位(U)，結果以U/g(FW)表示；POD活性的測定，2 mL 0.1% H2O2，0.95 mL 0.2%愈創木酚，50 μL粗酶液，迅速比色，以每分鐘變化0.01為1個酶活力單位(U)，結果以U/g(FW)表示；SOD活性的測定，在4 000 lx的光強下反應20 min，分別測定560 nm處各反應液的吸光值，以抑制氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化還原的50%為1個酶活力單位(U)，結果以U/g(FW)表示。以上指標重復3次測定取平均值。

1.4 數據統計

使用SPSS Statistics 21和Excel 2010繪制圖表，用Duncan 多重比較法分析差異顯著性，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 冷藏對果實MDA含量的影響

MDA是活性氧對細胞膜脂過氧化的產物，是評價膜結構損傷程度的指標之一[11-13]。冷藏條件下果實的汁胞MDA含量變化相對穩定，前50 d汁胞中的MDA含量均低于對照組(圖1-A), 50 d時差異達到顯著水平(P<0.05)，冷藏減輕汁胞膜脂過氧化程度，維持汁胞細胞膜結構的完整；白皮層的MDA含量在貯藏過程中整體呈下降的趨勢(圖1-B)，冷藏條件下70 d時MDA含量顯著(P<0.05)高于對照組，可能是因為蛋白質、核苷酸和糖類等多種非脂類生物分子降解也可產生MDA[14]；冷藏條件下的外果皮MDA含量始終高于對照組(圖1-C)，原因是冷藏條件下外果皮的細胞膜結構損傷大于對照組。可見，果實不同部位的膜脂過氧化程度不同，其中膜脂過氧化傷害最嚴重的部位是汁胞，白皮層次之，外果皮最輕，冷藏減少了汁胞中MDA的積累，能延緩紅肉蜜柚汁胞衰老進程。

圖1 紅肉蜜柚貯藏過程中汁胞(A)、白皮層(B)、外果皮(C)的MDA含量變化Fig.1 Changes of MDA content in juice sacs (A), white cortex (B) and peel (C) of Red-fleshed sweet pomelo during storage注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2 冷藏對果實H2O2含量的影響

H2O2是活性氧表現形式的一種，因為它具有較高的氧化還原活性，過度積累能引起細胞內含巰基的多種酶和蛋白失活，最終會影響果實的生理調控和代謝。冷藏10 d時的汁胞、白皮層和外果皮的H2O2含量均顯著高于(P<0.05)對照組，可能是因為在正常細胞當中，適量活性氧含量的增加，可提高果實對低溫的應激性[15-16]。在整個貯藏過程中，冷藏30 d后的汁胞(圖2-A)H2O2含量低于對照組，冷藏能減少果實汁胞和白皮層H2O2的積累；果實外果皮冷藏50 d時H2O2含量顯著(P<0.05)高于對照組，受果實H2O2清除系統影響下降至80 d后上升(圖2-C)，對照組貯藏30 d時達到峰值后波動下降至70 d后上升，冷藏能在貯藏前80 d降低果實外果皮H2O2的積累，保持外果皮正常的生理代謝。

圖2 紅肉蜜柚貯藏過程中汁胞(A)、白皮層(B)、外果皮(C)的H2O2活性的變化Fig.2 Changes of H2O2 content of juice sacs (A), white cortex (B) and peel (C) of red-fleshed sweet pomelo during storage

2.3 冷藏對果實CAT活性的影響

CAT主要存在于過氧化物酶體和乙醛酸循環系統中，可以催化H2O2生成H2O和O2，從而保護膜不受傷害[17-18]，由圖3可知，在果實貯藏前期，CAT活性呈現下降趨勢。隨著貯藏時間的延長，果實緩慢衰老，50 d后2組CAT活性變化趨勢相同，50 d時酶活性上升，70 d達到最大值后下降，50～70 d冷藏汁胞的酶活性顯著高于對照組(圖3-A)；60 d后冷藏白皮層CAT活性高于對照組，50 d后外果皮CAT活性高于對照組。表明冷藏能維持果實CAT較高的生理活性，延緩果實衰老進程，延長果實貯藏保鮮期；紅肉蜜柚不同部位的CAT活性為汁胞<白皮層<外果皮。

2.4 冷藏對果實POD活性的影響

POD可催化低濃度的H2O2氧化酚類，貯藏前期與CAT相互協調清除植物體內的H2O2，貯藏后期參與果實的衰老[19-20]。冷藏果實汁胞POD活性變化相比對照組較為穩定，50 d時顯著低于(P<0.05)對照組(圖4-A)；冷藏白皮層的POD活性在60 d后有上升趨勢，較對照組有明顯增強(P<0.05)。外果皮的POD活性(圖4-C)分別是汁胞和白皮層的120、30倍。酶活性的增強可維持外果皮的正常生理狀態，使柚果在衰老過程中汁胞粒化而外果皮無明顯變化，這與張世怡等[21]研究結果相一致。結果表明，低溫能維持較高的POD活力，果實不同部位的POD活性為：汁胞<白皮層<外果皮。

圖3 紅肉蜜柚貯藏過程中汁胞(A)、白皮層(B)、外果皮(C)的CAT活性變化Fig.3 Changes of CAT activity of juice sacs (A), white cortex (B) and peel (C) of red-fleshed sweet pomelo during storage

圖4 紅肉蜜柚貯藏過程中汁胞(A)、白皮層(B)、外果皮(C)的POD活性變化Fig.4 Changes of POD activity of juice sacs (A), white cortex (B) and peel (C) of red-fleshed sweet pomelo during storage

2.5 冷藏對果實SOD活性的影響

由圖5-A可知，冷藏果實汁胞的SOD活性在前20 d緩慢下降，30 d后上升后顯著(P<0.05)高于對照組；白皮層SOD活性呈現波動上升趨勢(圖5-B)，貯藏40 d時，冷藏果實白皮層SOD活性低于對照組1倍。果實貯藏80 d時，冷藏白皮層SOD活性顯著(P<0.05)高于對照組，冷藏能維持貯藏后期白皮層SOD的活性；對照組外果皮的SOD活性40 d達到最大值，冷藏60 d達到最大值，表明冷藏更有利于維持果實內活性氧的平衡，延長果實的保鮮貯藏期。果實不同部位的SOD活性與POD、CAT相似。

圖5 紅肉蜜柚貯藏過程中汁胞(A)、白皮層(B)、外果皮(C)的SOD活性變化Fig.5 Changes of SOD activity of juice sacs (A), white cortex (B) and peel(C) of red-fleshed sweet pomelo during storage

3 討論

果實采后衰老是一個復雜的生理過程。活性氧清除系統主要包括非酶促和酶促兩大類，酶促系統主要包括CAT、POD、SOD等多種酶。以果實內MDA和H2O2的含量，以及活性氧代謝相關酶的酶活性高低揭示果實在衰老過程中的活性氧變化[22-24]。冷藏紅肉蜜柚汁胞MDA含量顯著(P<0.05)低于對照組，汁胞膜脂過氧化程度較低，細胞膜較為完整，能阻斷汁胞內營養物質轉移；冷藏果實白皮層與對照組相比，貯藏前期MDA含量持續下降，H2O2含量80 d出現峰值, CAT、POD和SOD隨之在80 d時出現活性高峰，對照組白皮層H2O2含量在80 d出現含量峰值，但是無酶活性高峰出現，表明冷藏果實白皮層在貯藏80 d后仍具有良好清除H2O2的能力，而對照組白皮層在80 d時，清除H2O2能力下降，則低溫能保持白皮層相關酶的活性，延緩果實白皮層的衰老進程。外果皮的酶活性最強，酶活性的增強能有效地減少外果皮H2O2的積累，減少MDA的產生，降低H2O2對細胞膜結構和功能的損害程度，低溫能延緩果實的衰老與李家政等[6]研究一致。

紅肉蜜柚果實汁胞CAT、POD、SOD活性最低，MDA含量最高，是果實中膜脂過氧化傷害程度最嚴重的部位；結合取樣觀察，對照組果實汁胞40 d出現枯水現象，SOD和POD活性在40 d時降至最低點，而MDA在50 d時含量升至峰值，CAT活性降至最低點，表明對照組果實汁胞H2O2含量在40 d時開始出現失控狀態，這個原因可能導致汁胞枯水的發生。細胞內適量的活性氧含量能調控防御機制，增強果實的抗氧化能力，如何控制果實內起調控作用的活性氧含量以增強果實的抗逆性，有待分子層面的進一步研究。

4 結論

果實的CAT、POD、SOD活性高低由外至內：外果皮>白皮層>汁胞。與對照組相比，隨著貯藏時間的延長，冷藏能保持果實較高的酶活性，減少汁胞MDA和H2O2的積累；柚果在衰老過程中汁胞出現枯水，外果皮無明顯表現，本次實驗結果表明：果實外果皮的酶活性最強，H2O2含量隨著貯藏時間的延長逐漸增加，MDA含量逐漸下降,貯藏至80 d，冷藏和對照組的H2O2含量分別上升了 1.25和1.24倍，MDA含量分別下降了2.4和4.1倍，表明果實的外果皮在貯藏后期仍具有較好的活性氧清除能力，保持了膜結構的完整，使果實的外果皮在貯藏過程中能保持較好的完整性。