金線蓮多糖抗衰老作用及其機制

劉青， 李永， 盛世美

(華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021)

衰老是生物體隨著年齡增長在形態(tài)結構和生理功能方面出現的一系列退行性變化，是正常且自然的過程.有學者認為，隨著衰老機體自由基產生和消除的不平衡，過量的自由基可損傷細胞膜、DNA結構，促進核酸及蛋白質分子內發(fā)生化學交聯，從而影響細胞的正常功能，最終導致細胞死亡[1].隨著衰老不斷進行，機體免疫系統(tǒng)開始老化，免疫功能下降.已有研究表明，多種植物多糖具有抗衰老作用[2-3]，它們的抗衰老作用與其抗氧化、免疫調理作用有關.金線蓮(Anoectochilusroxburghii)又名金線蘭、金石松等，為蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬植物，是我國名貴中藥材，具有清熱涼血、祛風利濕等功效[4].金線蓮多糖是金線蓮的主要活性成分之一.近年來的研究發(fā)現，金線蓮多糖具有良好的體外抗氧化[5]、免疫調節(jié)[6-7]、降血糖[8-9]及抗腫瘤作用[10]，然而，未見金線蓮多糖在抗衰老方面的報道.因此，本文將對金線蓮多糖改善衰老小鼠腦功能退化作用進行研究.

1 材料與方法

1.1 金線蓮多糖的提取[11]

將金線蓮干品切碎，用體積分數為80%的乙醇提取，提取液過濾后，將干燥殘渣放入90 ℃的蒸餾水中提取3次，每次1 h；提取液混合濃縮后，加入5倍體積的無水乙醇沉淀24 h；然后，將沉淀物溶解在60 ℃熱水中，采用Sevag法去蛋白，并用水透析48 h；最后，用無水乙醛、丙酮和乙醚洗滌沉淀，得到金線蓮多糖，并用苯酚硫酸法測定多糖的純度.所得的金線蓮多糖純度為94.5%，且該多糖在260，280 nm處沒有紫外吸收，將提取的金線蓮多糖命名為ARP.

1.2 實驗動物

SPF級昆明小鼠，雌雄各半，體質量為18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號為SCXK(滬)2017-0005.小鼠飼養(yǎng)在標準動物實驗室中，所有操作均符合華僑大學實驗動物管理倫理委員會的要求.

1.3 實驗試劑和儀器

D-半乳糖(北京拜爾迪生物技術有限公司)；維生素E膠丸(福建省廈門星鯊藥業(yè)集團)；過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、血清血清總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和蛋白測定試劑盒(江蘇省南京建成生物工程研究所)；抗體 p-NF-κB p65和β-actin(美國貝弗利Cell Signaling Technology公司)；其他試劑均為國產分析純.

用蒸餾水將1 000 mg·kg-1的D-半乳糖溶液配成40 mg·kg-1的D-半乳糖溶液用于皮下注射；將維生素E(VE)溶解在玉米油中，配成200 mg·kg-1的維生素E溶液待用.

BS110S型電子天平(德國Sartorius公司)；旋轉蒸發(fā)儀(瑞士Buchi 公司)；752型紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；JL BeHv型動物行為分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)；DDY-10型三恒電泳儀、半干轉印槽、全自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司).

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠衰老模型 小鼠78只，隨機分為6組，雌雄各半，每組13只.除空白對照組外，其余各組小鼠每天頸部皮下注射D-半乳糖溶液(40 mg·kg-1)，建立小鼠衰老模型[12].造模期間，陽性對照組小鼠灌胃給予維生素E(200 mg·kg-1)，金線蓮多糖組小鼠則分別灌胃給予不同劑量的金線蓮多糖水溶液(100，200，300 mg·kg-1，分別編號ARP1，ARP2，ARP3)進行治療.6周后，每組隨機取10只小鼠進行行為學實驗，包括曠場、強迫游泳和跳臺實驗.實驗8周后，宰殺這些小鼠，取小鼠胸腺，測定胸腺指數；取小鼠大腦皮層，測定大腦皮層p-NF-κB p65的表達，以及抗氧化酶CAT，SOD活性，并測定小鼠血清中T-AOC活性和MDA濃度.每組剩下的3只小鼠，在最后一次給藥后1～2 h，用于免疫學實驗.

1.4.2 小鼠外觀觀察及體質量稱量 觀察實驗期間各組小鼠的生長情況、外觀與體質量變化.

1.4.3 曠場實驗 使用開口為40 cm×40 cm×35 cm(長×寬×高)的藍色塑膠制實驗箱，將軟質黑色墊板墊在箱底部，方便小鼠爬行.實驗時，所有小鼠均提前適應環(huán)境3 min，每只小鼠測試一次.將小鼠放入實驗箱的中心位置，在實驗箱中自由探索環(huán)境5 min，記錄每只小鼠在這5 min內的運動時間、運動速度和后肢直立的次數(包括攀附箱壁和兩支前爪騰空的次數).

1.4.4 強迫游泳實驗 使用直徑為40 cm，高為30 cm的無色透明塑料制實驗箱，箱內裝有干凈且溫度適合的水供小鼠游泳.實驗時，所有小鼠均提前適應環(huán)境，每只小鼠測試一次.將小鼠提尾置于實驗箱中心位置的正上方，隨后松手使小鼠自由落體入水，讓小鼠在水中游泳5 min，記錄每只小鼠5 min內的游泳時間.

1.4.5 跳臺實驗 采用25 cm×25 cm×30 cm(長×寬×高)的小鼠跳臺反應箱，將其分為4間，箱底為可通36 V連續(xù)電刺激的銅柵.每間中間放置一直徑為12 cm，高為4.5 cm的橡皮墊作為小鼠回避電擊的安全區(qū).首先，將小鼠置于跳臺儀中，適應環(huán)境3 min；然后，底部銅柵通以36 V交流電.記錄小鼠受到電刺激后跳上橡皮墊的反應時間，以及5 min內的錯誤次數(受到電擊的次數).24 h后，再次將小鼠置于跳臺儀中適應3 min，然后將其置于橡皮墊上，記錄第1次跳上橡皮墊的潛伏期，作為記憶成績.

1.4.6 生化檢測 按照試劑盒說明書操作要求，測定小鼠大腦皮層CAT，SOD活性，血清T-AOC活性和MDA濃度.

1.4.7 Western Blot檢測 采用提取試劑盒提取小鼠大腦皮層總蛋白，測定蛋白濃度，加熱使之變性，上樣量30 μg；然后，經體積分數為10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將蛋白轉至硝酸纖維素膜上；經體積分數為5%的脫脂奶粉封閉1 h后，加入相關一抗(anti-p-NF-κB p65稀釋體積比為1∶500，anti-β-actin稀釋體積比為1∶500)，4 ℃過夜，經TBST緩沖液洗3次后，加入相關二抗封閉液(稀釋體積比為1∶5 000)封閉1 h；采用電化學(ECL)發(fā)光法，掃描記錄，并采用Image J軟件測定條帶灰度值，結果以β-actin為內參.

1.4.8 腹腔巨噬細胞吞噬實驗[13]最后一次給藥后1～2 h，給每組剩余的3只小鼠，腹腔注射1 mL體積分數為1%的雞紅細胞懸液，輕揉腹部使雞細胞分散.20 min后，處死小鼠，消毒后剪開皮膚，經腹腔注入2.5 mL生理鹽水.輕揉小鼠腹部1 min，用移液槍吸取腹腔液，涂片，于37 ℃孵育30 min.取出玻片，漂洗，除去未貼片的細胞，晾干.以體積比為1∶1的丙酮甲醇液固定5 min，再用瑞氏姬姆薩染液染色，漂洗，晾干，在油鏡下記錄200個巨噬細胞中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數，及每個巨噬細胞中被吞噬的雞紅細胞數.吞噬指數(IP)和細胞吞噬百分率(η)的計算式分別為

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 小鼠的外觀及體質量變化

圖1 小鼠體質量變化(n=10)Fig.1 Weight change in mice (n=10)

觀察可知：實驗期間，各組小鼠生長良好，飲食及活動自由，未發(fā)生死亡；隨著給予小鼠D-半乳糖注射時間的延長，模型組小鼠出現毛發(fā)粗糙發(fā)黃、反應遲鈍、食量減少等現象；空白對照組及藥物治療組小鼠的毛較光滑、顏色較正常、活潑好動.

在實驗周期中，小鼠的體質量變化，如圖1所示.圖1中：m為小鼠的體質量；t為實驗時間；n為每組小鼠的數量.由圖1可知：相比于其他給藥組小鼠，模型組小鼠的體質量增長更緩慢.

2.2 小鼠的行為學能力

(a) 運動時間

(b) 運動速度 (c) 后肢直立的次數圖2 不同實驗組小鼠在5 min內的活動結果(n=10)Fig.2 Movement results of each group mice in 5 minutes (n=10)

通過觀察和檢測小鼠在新環(huán)境中的運動探究行為和自主活動行為，測試小鼠的運動能力、空間探索能力、學習能力和記憶能力[14].不同實驗組小鼠在5 min內的活動結果，包括運動時間(te)、運動速度(v)和后肢直立的次數(N),如圖2所示.圖2中：與空白對照組相比，“**”表示P<0.01;與模型組相比,“#”表示P<0.05，“##”表示P<0.01.

由圖2可知：與空白對照組相比較，衰老模型組小鼠的運動時間、運動速度和站立次數均顯著下降(P<0.01)；與衰老模型組小鼠相比，經不同劑量金線蓮多糖和VE治療后，小鼠的運動時間、運動速度和站立次數均明顯增加(P<0.01，P<0.05)，說明金線蓮多糖和VE能使衰老小鼠的運動、空間探索、學習和記憶能力有明顯改善.

2.3 小鼠的抗疲勞能力

每組小鼠在5 min內的游泳時間，如圖3所示.圖3中：ts為游泳時間.

由圖3可知：與空白對照組相比，衰老模型組小鼠在5 min內的游泳時間顯著減少(P<0.01)，衰老模型組小鼠的體力差；與衰老模型組相比，金線蓮多糖治療各組及VE組小鼠的游泳時間均明顯延長(P<0.05，P<0.01)，說明金線蓮多糖能改善衰老小鼠的耐力，提高其抗疲勞能力.

2.4 小鼠的被動學習記憶能力

跳臺實驗常用來測試小鼠被動學習記憶能力.各組小鼠2次上臺潛伏期，如圖4所示.圖4中：ti為小鼠的上臺潛伏期.

圖3 各組小鼠在5 min內的游泳時間(n=10) 圖4 各組小鼠2次上臺潛伏期(n=10) Fig.3 Swimming time of each group mice Fig.4 Two incubation periods of in 5 minutes (n=10) each group mice (n=10)

由圖4可知：在第1次測試中，各組小鼠的上臺潛伏期差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；但在第2次記憶重現測試中，衰老模型組小鼠的上臺潛伏期明顯長于空白對照組小鼠，表明衰老小鼠的學習能力沒有空白對照組小鼠好；經金線蓮治療后，各治療組小鼠的上臺潛伏期均明顯縮短，與衰老模型組小鼠相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，這說明給予一定劑量的金線蓮多糖對衰老小鼠的被動學習記憶能力有促進效應.

2.5 小鼠的抗氧化能力

抗氧化酶對機體的氧化和抗氧化平衡起著重要作用，它能清除自由基，保護細胞免受損傷.各組小鼠大腦皮層及血清的抗氧化酶活性和血清中的MDA濃度，如表1所示.表1中：c(MDA)為血清中的MDA的濃度；IT為胸腺指數；z(SOD),z(CAT),z(T-AOC)分別為SOD，CAT，T-AOC的活性.

由表1可知：與空白對照組相比，衰老模型組小鼠大腦皮層和血清抗氧化酶(SOD，CAT，T-AOC)活力均顯著降低(P<0.01)；而衰老模型組小鼠血清的脂質過氧化產物MDA濃度顯著升高，說明衰老小鼠的抗氧化能力明顯減弱；給予金線蓮多糖治療后，衰老小鼠的抗氧酶活力均升高，中、高劑量金線蓮多糖治療組小鼠的抗氧化酶活力表現出明顯改善(P<0.05，P<0.01)；相應地，經金線蓮多糖治療后，衰老小鼠血清MDA的濃度也下降，中、高劑量金線蓮多糖治療組小鼠的血清MDA濃度表現出明顯降低(P<0.05，P<0.01)，結果表明，給予金線蓮多糖能提高衰老小鼠抗氧化能力；與空白對照組小鼠相比，衰老模型組小鼠的胸腺指數明顯減小(P<0.01)，而經金線蓮多糖治療后，衰老小鼠的胸腺指數明顯增加(P<0.05，P<0.01)，說明金線蓮多糖能改善衰老小鼠的胸腺萎縮.

組別IT/mg·g-1z(SOD)/μkat·L-1z(CAT)/μkat·L-1z(T-AOC)/μkat·L-1c(MDA)/mol·L-1空白對照組2.12±0.133 318.33±276.22319.90±49.84370.07±82.6813.34±2.09 模型組1.31±0.16**2 503.50±414.58**190.70±65.18**243.71±51.68**24.32±5.03**VE組1.92±0.13##3 182.30±280.72##300.73±62.35##312.73±33.01#18.44±3.40##ARP1組1.57±0.13#2 800.73±431.59193.20±67.35249.72±32.8421.32±3.17ARP2組1.84±0.13##3 042.27±377.24##254.38±74.35#301.06±62.68#20.07±2.56#ARP3組1.91±0.09##3 090.45±162.53##286.22±64.35#306.89±40.84#18.76±3.75##

2.6 p-NF-κB p65的蛋白表達

p-NF-κB p65的相對蛋白表達量分析及 p-NF-κB p65表達量，如圖5所示.圖5中：D為相對蛋白表達量.

由圖5可知：與空白對照組相比，衰老模型組小鼠大腦皮層p-NF-κB p65的蛋白表達水平明顯上調；經金線蓮多糖治療后，衰老小鼠大腦皮層p-NF-κB p65蛋白表達水平隨金線蓮多糖治療量的增加而逐步降低，說明金線蓮多糖能抑制衰老小鼠大腦皮層NF-κB 的信號通路.

(a) 相對蛋白表達量 (b) 表達量圖5 p-NF-κB p65的相對蛋白表達量分析及 p-NF-κB p65表達量(n=3)Fig.5 Analysis of relative protein expression and expression of p-NF-κB p65 (n=3)

2.7 小鼠巨噬細胞吞噬指數和吞噬百分率

小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗結果，如圖6所示.由圖6可知：與空白對照組比較，衰老模型組小鼠的巨噬細胞吞噬指數與吞噬百分率明顯降低；經金線蓮多糖治療后，衰老小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬百分率與吞噬指數能力隨著金線蓮多糖使用量的增加而逐步提高，說明金線蓮多糖能提高衰老小鼠的免疫力.

(a) 吞噬指數 (b) 吞噬百分率圖6 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗結果(n=3)Fig.6 Peritoneal macrophage phagocytosis test results (n=3)

3 討論

由于衰老機體自由基產生和消除的不平衡，過量的自由基可影響細胞的正常功能，最終導致細胞死亡.D-半乳糖能使體內產生大量的超氧陰離子，從而導致組織器官過氧化損害，這與自然衰老的表現相似.因此，D-半乳糖被廣泛用于制造衰老模型.研究結果顯示，經D-半乳糖皮下注射8周后，小鼠大腦皮層和血清抗氧化酶活性明顯下降，而脂質過氧化中間產物MDA的濃度卻顯著上升，表明此時小鼠體內氧自由基的清除失衡.

NF-κB信號通路是氧化應激敏感的信號通路.實驗中，衰老小鼠大腦皮層抗氧化酶活性降低，氧自由基的清除失衡，氧自由基產生增多，激活了小鼠大腦皮層NF-κB信號通路，使p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著上調.NF-κB信號通路在炎癥反應中起中心調控作用，其激活可引起下游多種炎癥反應[15]，中樞神經炎癥反應會促進腦衰老相關認知功能障礙性疾病的發(fā)展.實驗結果顯示，衰老小鼠出現行為學變化，小鼠的運動能力、空間探索、學習和記憶能力均明顯遲緩.

衰老與免疫系統(tǒng)結構和功能改變密切相關.隨著年齡的增加，機體自由基積累逐漸增多，引起免疫功能改變，導致免疫系統(tǒng)衰老，免疫器官逐漸萎縮，器官功能下降，使免疫器官對外界抗原的反應緩慢，清除抗原的能力降低[16].實驗結果顯示，與空白對照組小鼠相比，衰老小鼠的胸腺指數下降，其腹腔巨噬細胞吞噬能力顯著下降.

金線蓮多糖是金線蓮的主要有效成分之一.近年來的研究結果顯示，金線蓮多糖有良好的體外抗氧化、免疫保護、降血糖作用.實驗中，與衰老小鼠相比，經不同劑量的金線蓮多糖治療后的小鼠大腦皮層和血清的抗氧化酶SOD，CAT，T-AOC均有顯著升高，而血清的MDA的濃度呈明顯的下降.這進一步表明金線蓮多糖有明顯的體內抗氧化作用，能有效改善衰老小鼠機體的氧化還原狀態(tài).

學習和認知能力減退是衰老的主要特點，經金線蓮多糖治療后，衰老小鼠大腦皮層的NF-κB信號通路被抑制，小鼠的運動能力、空間探索、學習和記憶能力都得到顯著改善，衰老小鼠的活力增加.

經金線蓮多糖治療后，隨著機體抗氧化系統(tǒng)平衡的恢復，免疫系統(tǒng)的功能得到改善.實驗結果顯示，金線蓮多糖能顯著提高衰老小鼠的胸腺指數和巨噬細胞的吞噬能力，說明金線蓮多糖能延緩衰老小鼠免疫器官萎縮，增強衰老小鼠清除抗原的能力.

綜上所述，金線蓮多糖的抗氧化作用能顯著抑制衰老小鼠大腦皮層的NF-κB信號通路，有效提高衰老小鼠的學習、認知能力，增強衰老小鼠的活力，提高衰老小鼠的免疫功能，從而起到明顯的抗衰老作用.金線蓮多糖改善衰老小鼠腦功能作用可能與其抗氧化、抑制衰老小鼠大腦皮層的NF-κB信號通路、增強衰老小鼠免疫功能有關.