干細胞源的外泌體調控細胞自噬在心肌損傷中作用的研究進展

心臟干細胞(cardiac stem cells，CSCs)被認為是修復損傷心肌的最佳途徑之一。CSCs 是未分化細胞，表達早期心肌細胞系的轉錄因子(Nkx2.5，GATA-4，Mef-2)。CSCs的特征是以克隆的方式進行自我更新，并且具有在體外和體內分化為多種心血管譜系細胞的能力，包括心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞等。在心臟發生病變時，CSCs增殖分化能對心臟的損傷進行修復。以CSCs為基礎的治療方法為心臟損傷后的修復提供了新的途徑。但由于干細胞直接移植的生存率非常低，越來越多的研究發現干細胞對于心肌損傷的保護作用可能更多來自旁分泌機制[1]。本課題組在前期研究中發現誘導多能干細胞源的外泌體(exosomes)可以傳遞對心肌細胞具有保護作用的miRNA-21/210，從而在心肌缺血再灌注后通過抗心肌細胞凋亡來保護受損傷的心肌[2]。 現就干細胞源的Exosomes和自噬在心肌損傷修復中的作用做一綜述。

1 Exosomes與心肌損傷

1.1 Exosomes的特征與功能 Exosomes是一種可由多種細胞分泌的納米級膜性囊泡，在電鏡下其外觀是一種特征性的“蝶形”小體，直徑為30～100 nm。研究表明，Exosomes內含有細胞特異性的信號分子、蛋白質、mRNA和miRNA。體外實驗表明，這些遺傳物質可以在靶細胞中翻譯與表達，在細胞間進行信息傳遞。Exosomes介導的信息傳遞方式[1]：①Exosomes膜配體可以激活受體或下游的信號通路；②Exosomes內含有活化的受體，可以在細胞之間轉運；③Exosomes內含有蛋白質，可以進行蛋白質的傳遞；④Exosomes內含有miRNA和RNA，可以進行遺傳物質的傳遞。

Exosomes具有小的雙層脂質膜，其可被大多數細胞釋放并可在大多數體液中檢測到。Exosomes通過將其包含的生物活性物質(如蛋白質和核酸)轉移到受體細胞或激活靶細胞中的信號傳導途徑來發揮細胞間通訊的關鍵功能[3-4]。前期實驗證實，通過PKH26 標記 Exosomes 后加入正在培養的細胞培養基里，2 h后熒光顯微鏡下可以觀察到PKH26標記的Exosomes 進入細胞漿內，因此，證明Exosomes可以在細胞之間穿梭從而發揮信息傳遞作用[2]。另外，Exosomes還可以用作在體及離體實驗中的藥物載體而用于治療[5]。

1.2 Exosomes與旁分泌 相關研究表明，注射入體內的干細胞本身并不是通過分化增殖產生新的心肌細胞而導致心臟功能改善，其中的機制顯然是一種旁分泌作用，即這些細胞釋放某種讓心臟變得更好的“物質”[6]。Sahoo等[7-8]發現CD34+的干細胞中提取的Exosomes富含促血管生成的miR-126，可以促進心肌梗死后新生血管的形成。Exosomes具有潛在的心肌保護作用，這種保護作用可能與其攜帶的信息分子、蛋白質、miRNA、RNA相關[9-10]。Gallo 等[11]研究發現，血清和唾液中可被檢測到的miRNA多數集中在Exosomes。Ji等[12]在實驗中證實血漿miR-208可以作為心肌損傷標志物，異丙腎上腺素誘導的心肌損傷后，miR-208的血漿濃度顯著增加。Exosomes攜帶的miRNA可能會成為心血管疾病新的生物標志物及治療靶標[13-16]。

1.3 miRNA與心肌損傷 miRNA是一類在基因轉錄后水平調控目的基因的功能性小RNA。Eulalio等[17]發現外源性miRNAs能顯著刺激心肌細胞增殖，促進心臟修復，通過高通量技術篩選出了40多種能顯著促進新生小鼠和大鼠心肌細胞DNA合成和胞質分裂的miRNA，進一步研究證實miR-590和miR-199a可以促進成體心肌細胞周期重啟，促進新生動物和成年動物的心肌細胞增殖。Wang等[18]研究發現，miRNA-103/107可以通過靶向Fas相關死亡結構域蛋白(Fas-associating death domain protein，FADD)調節程序性壞死和心肌缺血/再灌注損傷。Xie等[19]通過減少高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達來研究miR-451是否保護心肌細胞缺氧/復氧(A / R)損傷，發現在A/R期間心肌細胞中miR-451的表達顯著降低，進一步研究發現miR-451的上調可以顯著減弱A/R期間心肌細胞活力的損失和增加細胞內超氧化物歧化酶(SOD)水平，表明miR-451的上調可以通過抑制HMGB1的表達來防止A/R誘導的心肌細胞損傷。但促進心肌修復的miRNA的篩選及干預時機尚待進一步研究。

2 自噬與心肌損傷

2.1 自噬的特征與分類 自噬是一種在真核生物中高度保守的細胞降解和再循環過程。在哺乳動物細胞中，自噬有3種主要類型：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperome-mediated autophagy，CMA)。雖然每個在形態上并不相同，但這3種自噬方式最終都在向溶酶體輸送貨物以進行降解和再循環。大自噬依靠新形成的雙層膜囊泡——自噬體，可以隔離待降解物質并將其運送到溶酶體內，小自噬通過溶酶體膜的內陷直接捕獲待降解物質，伴侶介導與小自噬不同，它不使用膜結構來隔離待降解物質，而是利用分子伴侶識別待降解物質上含有特定肽鏈的蛋白，直接將未折疊蛋白轉運到溶酶體膜上。自噬是細胞的一種自我保護機制，但過度自噬往往是有害的。通過對細胞自噬的調控來治療疾病已經成為一個極具潛力的研究方向。

2.2 自噬與干細胞 研究發現，血液的產生是由稀有的、自我更新的造血干細胞(HSC)來保證的，而自噬是保護造血干細胞免受代謝應激的重要機制[20]。研究發現，在新鮮分離的年輕小鼠造血干細胞和分化的HSC子細胞(其中包括免疫細胞粒細胞和巨噬細胞的祖細胞)中，自噬很少發生或不發生，而當細胞處于饑餓狀態時，自噬會被加速誘導，而在這樣的壓力狀態下，主動抑制自噬，造血干細胞會快速凋亡[21]。研究證實自噬可以有效抑制造血干細胞的新陳代謝，最終保存了造血干細胞的自我更新能力[22]。缺血性心臟病的治療中，科學家越來越多寄希望于心臟干細胞移植，這其中細胞自噬對維持細胞穩態發揮著非常重要的作用，研究發現在干細胞治療中Exosomes、miRNAs和細胞自噬可能協同發揮作用[23]。有研究證實，心臟干細胞來源的Exosomes高表達miRNA-451[24]，可以作為一種非細胞的載體保護缺血再灌注損傷。有報道miR-451直接靶標結節性硬化癥蛋白1(TSC1)是細胞自噬的正向調控因子，可以對缺血心肌細胞起到保護作用[25]。

在心臟發育的各個階段細胞自噬都發揮著重要作用，在斑馬魚心臟胚胎發育中，敲除自噬基因Beclin1、 Atg5和 Atg7會引起細胞死亡和復雜的心臟結構異常[22，26]。Decker等[27]研究發現，缺血再灌注損傷可誘導心肌細胞發生自噬，在對兔的心肌細胞進行20～40 min的缺氧處理后，自噬泡開始出現，而當氧供恢復后，自噬泡數量明顯增加，且在急性或慢性缺血條件下自噬均可被啟動，在再灌注階段自噬又會進一步增強。在急性心肌梗死的修復損傷心肌的治療中干細胞一直以來都是臨床尋求的一個非常有效的方法和途徑，干細胞移植中有很多機制在發揮作用，這其中調控細胞自噬是干細胞發揮修復損傷心肌的重要作用之一[28-30]，詳見圖1。也有研究證實，一些天然產物比如白藜蘆醇、黃連素、姜黃素可以調控細胞自噬來參與心血管疾病的損傷修復[31]。

圖1心肌梗死和心力衰竭發生過程中自噬促進心肌再生的示意圖

3 問題與思考

心臟干細胞盡管在臨床治療心肌梗死后心肌損傷修復中可能會有非常好的應用前景，但移植細胞的高死亡率、移植的途徑及移植細胞帶來的風險仍是限制干細胞在臨床應用的主要問題。細胞自噬具有維持細胞自穩的功能，Exosomes特異的miRNA是否通過調控心肌細胞自噬從而參與心肌細胞損傷的修復受到越來越多的關注。