一種治療奶牛陰道炎癥微生態制劑的臨床藥效學研究

張林沖，賀鳳英，程 超,3*

(1.金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010030；2.內蒙古雙奇藥業股份有限公司，呼和浩特 010010；3.內蒙古集寧師范學院，內蒙古集寧 012000)

奶牛生殖道炎癥是奶牛養殖業最常見的疾病之一，可引起奶牛繁殖障礙等疾病，給畜牧業造成極大經濟損失。隨著診療技術的發展，人們逐漸發現奶牛生殖道炎癥多數是由奶牛陰道炎癥繼發感染而引起的。目前，治療奶牛陰道炎癥多數使用中藥及抗生素，但由此也導致了細菌耐藥性及殘留等問題。因此，尋找中藥及抗生素以外的途徑治療奶牛陰道炎癥已成為人們關注的熱點。

微生態制劑是利用其所治療部位正常的益生菌成員，尤其是此部位的優勢菌株制成的活菌微生物制劑，不僅具有抑菌功能，還具有增強機體免疫力等益生功能，且不易引起細菌耐藥性，對人畜無毒副作用，因此益生乳酸菌制成的微生態制劑已被廣泛應用于臨床實踐，在維持或調整機體微生態平衡、防治疾病方面發揮了重要作用，但是利用微生態制劑治療牛體生殖道炎癥的報道則較少。有研究表明，乳酸菌菌株接種于奶牛炎性子宮，可減少奶牛陰道膿性分泌物[1]，降低子宮感染的發生率，激發奶牛子宮內膜的細胞防御機制，調節局部和全身免疫反應，提高繁殖性能[2]。

本研究以患有陰道炎癥的奶牛作為試驗對象，將健康奶牛陰道內分離篩選出的具有抑菌特性的優勢菌株約氏乳桿菌SQ0048菌株所制備成的微生態制劑應用于患牛陰道內，觀察檢測此微生態制劑對臨床型奶牛陰道炎癥的影響，評價療效，以便為其在臨床上的合理應用提供試驗依據。

1 材 料

1.1 試驗動物 選擇經獸醫診斷的無抗菌藥物用藥史的患陰道炎癥的成年荷斯坦奶牛25頭，體重均為400～600 kg。

1.2 試驗場所 具有一定規模性且管理規范的內蒙古呼和浩特市托克托縣青創牧場；內蒙古農業大學農業部動物疫病臨床診斷與治療重點實驗室。

1.3 菌株及藥品 約氏乳桿菌SQ0048菌株，由內蒙古雙奇藥業股份有限公司分離、鑒定并保存，已獲專利，專利證書公告號：CN103070890B。約氏乳桿菌SQ0048微生態制劑低劑量(批號20150520)、中劑量(批號20150301)、高劑量(批號20150408)均由內蒙古雙奇藥業股份有限公司制備。清宮促孕液(批號20150707)購自杭州新元亨動物藥業有限公司奶牛研究所。

1.4 主要試劑 MilliQ 水、甲醛、TEMED、Tris堿、電泳Marker(10000 bp、2000 bp)均購自大連寶生物有限公司；尿素、甲酰胺、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、過硫酸銨、溴酚藍、二甲苯青、冰乙酸、EDTA、無水乙醇、甲醛均購自上海聯碩寶為生物科技有限公司；DNA試劑盒和瓊脂糖凝膠試劑盒購自OMEGA E.Z.N.A公司；ELISA試劑盒(批號20150427)購自上海酶聯生物科技有限公司。

2 方 法

2.1 試驗分組 將25頭患牛(月齡為0～70月齡之間)隨機分為5組，即陰性對照組、陽性對照組、高劑量試驗組、中劑量試驗組及低劑量試驗組，每組5頭(表1)。

表1 臨床療效觀察試驗分組

2.2 給藥方案 患牛陰道灌注給藥。約氏乳桿菌SQ0048微生態制劑高、中、低劑量試驗組每天陰道給藥均為5 g/袋制劑，將1袋制劑用40 mL的生理鹽水充分溶解，使用輸精槍直接灌注于奶牛陰道內，1次/d，連續灌注9 d。陽性對照組灌注清宮促孕液250 mL，1次/d，連續灌注9 d；陰性對照組灌注生理鹽水250 mL，1次/d，連續灌注9 d。

2.3 臨床癥狀治療效果研究 給藥前及給藥后第3、5、7、9天和停藥后第45天，觀察并記錄各組受試奶牛的臨床癥狀(精神、食欲、不良反應、陰道及子宮的狀態)、檢測陰道分泌物狀態(色澤、氣味)，給藥后2個月檢測發情率，給藥后3個月檢測受胎率。

判定標準：(1)剔除標準：患有重度、急性陰道炎癥的奶牛；(2)納入標準(入選標準)：患有慢性、輕中度陰道炎癥的奶牛；(3)剝脫標準：患有重度膿性陰道炎癥的奶牛，或同時患有其他炎癥病癥的奶牛；(4)診斷標準：見表2；(5)治愈標準：牛體可常呈站立姿勢，眼觀外陰無紅腫，內陰無膿性分泌物粘液流出或流出粘液為無色透明狀且無氣味；肛探陰道、子宮不腫脹、松弛，恢復正常狀態。

表2 臨床診斷標準

2.4 實驗室細菌學治療效果研究 檢測給藥前及給藥后45 d陰道分泌物樣本微生物種屬的變化。首先使用消毒棉簽在患牛陰道穹窿后部、距宮頸2～3.5 cm 處取樣，然后將樣本立即置于無菌離心管中，冰盒冷藏。實驗時將裝有樣本的離心管內加入3 mL滅菌生理鹽水，漩渦震蕩洗脫，12000 r/min 離心10 min，棄掉上清液，將沉淀提取DNA，并進行聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR引物序列為：357f：GCCGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG；517r：ATTACCGCGGCTGCTGG進行。PCR 反應體系為(25 μL)：ddH2O 7.5 μL，2×Ultra-pfu- PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物(10 pmol/L) 1.0 μL，下游引物(10 pmol/L)1.0 μL，Template DNA 3.0 μL。PCR 反應條件為：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 共計10個循環；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 共計10個循環；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min 共計10個循環；72 ℃延伸5 min。而后將PCR產物進行DGGE電泳，實驗操作按照武志華等[3]的研究進行。將DGGE電泳的顯著性條帶切膠回收，再次進行PCR擴增，PCR引物為：357f：CCTACGGGAGGCAGCAG；517r：ATTACCGCGGCTGCTGG，反應條件同上。將獲得的顯著性條帶PCR產物進行測序，測序結果置于GenBank 數據庫中的BLAST軟件比對。

2.5 炎性介質、炎性因子治療效果研究 使用無菌采血針采集清晨未飼喂的患牛血液4 mL，傾斜放置2 h，而后8000 r/min 離心4 min，取上清液置于新離心管內，利用ELISA方法[4]檢測給藥前以及給藥后60 d血清樣本的炎性因子及炎性介質分泌量的變化。

3 結果與分析

試驗期間，各組試驗奶牛均未出現與受試藥物相關的不良反應。

3.1 臨床癥狀治療結果 給藥后，約氏乳桿菌SQ0048微生態制劑高、中、低劑量試驗組與陽性對照組的臨床癥狀治愈率、發情率及受胎率均高于陰性對照組，高劑量試驗組、中劑量試驗組的臨床癥狀治愈率、受胎率均高于陽性對照組，高劑量試驗組的發情率高于陽性對照組。結果見表3。

表3 臨床癥狀治療結果

給約氏乳桿菌SQ0048微生態制劑前后患牛情況變化結果見圖1。結果顯示：患牛陰道炎癥治療前，外陰紅腫，明顯流有白色粘液，帶有腥臭味，患畜喜躺臥，給約氏乳桿菌SQ0048微生態制劑后，外陰恢復，無粘液流出，患畜可站立。

圖1 給藥前后患牛樣本

3.2 實驗室細菌學治療效果 結果見表4。陰性對照組在給藥前后，微生物菌群種屬變化差異不顯著，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、念珠狀鏈球菌(Streptococcusmoniliformis)菌體數量開始增加，同時出現了化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes)、微單胞菌(Sporanaerobactersp)，提示本研究中生理鹽水對菌群種屬無改變。陽性對照組在給藥前后，化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes)、精子放線菌(Actinobacillusseminis)、嗜水汽單孢菌(Aeromonashydrophila)依舊存在，但是其他菌體如，銅綠假單胞菌及鏈球菌(Streptobacillussp)數量變少或消失，提示清宮促孕液可能能夠殺滅銅綠假單胞菌及鏈球菌，但是對化膿隱秘桿菌、嗜水汽單孢菌無作用。低劑量試驗組給藥后，炎性陰道內微生物菌體種類主要由銅綠假單胞菌、精子放線桿菌、利氏卟啉單胞菌(Porphyromonaslevii)改變為約氏乳桿菌SQ0048微生態制劑主要菌株L.johnsonii及谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)、Amycolatopsishalophila，其中L.johnsonii、谷氨酸棒狀桿菌菌體數量占有優勢。中劑量試驗組給藥前后，微生物菌群主要種屬與低劑量給藥組幾乎相同，但是鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)以及Amycolatopsishalophila消失，而約氏乳桿菌SQ0048微生態制劑主要菌株L.johnsonii、谷氨酸棒狀桿菌、嗜水汽單孢菌則占有主要優勢。高劑量試驗組同中劑量組給藥結果幾乎相同，提示以約氏乳桿菌SQ0048微生態制劑菌株制備的微生態制劑可以減少或殺滅陰道內的利氏卟啉單胞菌、銅綠假單胞菌、化膿隱秘桿菌及鏈球菌等，增加L.johnsonii及谷氨酸棒狀桿菌的數量，改變陰道微生態環境，維持陰道的微生態平衡。

表4 給藥前后菌體種屬結果

3.3 給藥前后炎性介質、炎性因子治療效果 結果見圖2。陰性對照組患牛血清中IL-1β、TNF-α及IFN-α水平在給藥前后無顯著性差異(P>0.05)，血清中IL-6水平在給藥后較給藥前極顯著性升高(P<0.01)，血清中IL-10水平在給藥后較給藥前極顯著性降低(P<0.01)，提示患牛炎癥可能并未得到任何緩解；陽性對照組患牛血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平在給藥后較給藥前顯著性降低(P<0.05)，血清中IL-10水平在給藥后較給藥前極顯著性升高(P<0.01)，提示患牛的炎癥可能在逐漸減輕；約氏乳桿菌SQ0048微生態制劑高、中、低劑量試驗組中患牛血清中IL-1β、IFN-α、TNF-α水平在給藥后較給藥前均顯著性降低或極顯著性降低(P<0.05或P<0.01)，患牛血清中IL-6水平在低劑量試驗組及中劑量試驗組給藥后較給藥前無顯著性差異，在高劑量試驗組，患牛血清中IL-6水平在給藥后較給藥前差異顯著性降低(P<0.05)，患牛血清中IL-10水平在給藥后較給藥前均極顯著性升高(P<0.01)，提示患牛的炎癥可能在逐漸減輕，且高劑量試驗組抑制炎癥效果要較中、低劑量試驗組效果明顯。

圖2 炎性因子及炎性介質結果

4 討論與結論

奶牛在飼養過程中，由于環境、飼喂、產后護理、自身疾病等原因導致奶牛陰道感染極為普遍，不僅影響了奶牛自身生長發育，還引起其他如子宮內膜炎、乳腺炎等疾病，嚴重的能引起奶牛不孕癥或流產等。目前有效治療奶牛陰道感染多使用中藥或抗生素療法，由此而導致的奶牛牛肉及牛奶獸藥殘留問題長期難以得到解決[5]。乳酸菌作為益生菌成員，其活菌及其代謝產物不僅具有抑菌功能，還能夠增強機體免疫力，且不易引起細菌耐藥性，對人畜無毒副作用[6]。一些現代研究已證實乳酸菌能夠抑制奶牛生殖道炎癥，減少奶牛子宮疾病的發生。

本實驗將健康奶牛陰道內分離篩選出的具有抑菌特性的優勢乳酸菌約氏乳桿菌SQ0048制成的微生態制劑應用于患有陰道炎的奶牛，研究顯示對奶牛陰道炎癥臨床癥狀的緩解具有一定的效果，且可提高受胎率及發情率。

實驗室細菌學治療效果研究顯示，陽性對照組及約氏乳桿菌SQ0048微生態制劑高、中、低劑量試驗組均可殺滅或減少炎性陰道內主要存在的菌群，諸如：嗜水汽單孢菌胞菌、鏈球菌、弗氏志賀菌、銅綠假單胞菌以及利氏卟啉單胞菌等。嗜水汽單孢菌是弧菌科氣單胞菌屬，此菌為條件致病菌，可以產生毒性很強的外毒素，當環境急劇變化的時候，常會混合感染其他疾病，使病情加重[7]。鏈球菌是化膿性球菌的另一類常見細菌，引起化膿性炎癥。弗氏志賀菌是細菌性痢疾的主要病原菌之一，常會引起炎癥反應。銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，此菌亦為條件致病菌，易引起傷口感染，導致菌血癥或敗血癥[8]。結果表明清宮促孕液與微生態制劑對炎癥奶牛陰道內主要菌群均具有一定的抑制作用。但是給藥后，陽性對照組陰道內，化膿隱秘桿菌、精子放線菌、嗜水汽單孢菌依舊存在，而中、高劑量試驗組微生物菌群主要改變為谷氨酸棒狀桿菌、嗜水汽單孢菌以及此微生態制劑的主要菌株L.johnsonii。谷氨酸棒狀桿菌是兼性好氧菌，非致病性菌屬。試驗證實中、高劑量試驗組對奶牛炎性陰道主要菌群具有一定的抑制和殺滅作用。

炎性介質、炎性因子治療效果研究顯示，低、中、高劑量試驗組中患牛血清中促炎性因子IL-1β、IFN-α、TNF-α水平在給藥后較給藥前極顯著性降低，高劑量試驗組患牛血清中促炎性因子IL-6水平在給藥后較給藥前差異極顯著性降低，血清中抑炎性因子IL-10水平在給藥后較給藥前極顯著性升高。IL-1β是炎性反應重要的細胞因子之一，在機體正常的生理條件下是處于不表達或弱表達狀態，但在機體病理條件下，其表達量會增加，誘導炎癥反應的發生[9]。IL-6同樣是炎性反應重要的細胞因子之一，當機體感染炎癥時，病變黏膜中的IL-6 mRNA的表達量以及蛋白表達量均明顯升高，與炎癥分級正相關，治療后IL-6濃度下降[10]。IL-10作為最重要的抑炎細胞因子，其表達量增加可以抑制促炎反應和限制炎癥引起的組織破壞[11]。IL-10可以抑制單核巨噬細胞產生的IL-1β、IL-6、TNF、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板活化因子(PAF)等因子的產生[12]。TNF-α是炎癥、免疫反應過程中重要的細胞因子，當表達量增加時，可導致機體免疫調節的紊亂，促進炎癥的發展，表達量降低時則可以抑制炎癥的發展。IFN-γ同樣是炎癥、免疫反應過程中重要的細胞因子，具有抗病毒、抗腫瘤的作用，還具有獨特的免疫調節功能，當表達量增加時，可導致炎癥的發展，表達量降低時則可以抑制炎癥的發展。很多文獻均證實乳酸菌可以調控炎性細胞因子的表達。Lin M H等研究顯示，B.pseudocatenulatumCECT7765可以抑制炎性細胞因子TNF-α和IL-6的產生[12]。由Lbs2乳酸菌菌株在免疫生物處理中降低了結腸組織中TNF-α、IL-12和IL-17的水平，同時增加了IL-10和TGF-β，顯著改善小腸結腸炎[13]。同樣，植物乳桿菌N14[14]和德氏乳桿菌TUA4408L[21]也證實了通過TLR2可調節細胞炎性因子的變化，降低IL-1β、IFN-γ表達，德氏乳桿菌TUA4408L作用免疫細胞，阻斷抗TLR2抗體，降低豬腸上皮細胞中IL-8水平[15]。試驗證實，以約氏乳桿菌SQ0048菌株制備的微生態制劑具有抑制促炎因子以及提高抑炎因子表達量的分泌作用。

綜上所述，以約氏乳桿菌SQ0048制備的微生態制劑運用于臨床型陰道炎患牛，可緩解臨床癥狀，改變陰道微生物菌群，改善陰道微生態環境，具有抑制炎癥的生物學功能，這為制備治療奶牛陰道炎癥的微生態制劑奠定良好試驗依據和理論基礎，對于臨床上減少抗菌藥物副作用，避免獸藥殘留對人體健康和公共衛生的危害性影響，具有非常重要的現實意義和社會效益。