淺談病理科小活檢標(biāo)本制作方法

劉華斌

（山西省腫瘤醫(yī)院病理科，山西 太原 030000）

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，以及國(guó)家對(duì)醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的大力扶持與投入，醫(yī)院病理科也迎來(lái)了發(fā)展的春天，病理為醫(yī)之本，然而作為病理科工作中的根本小標(biāo)本活檢技術(shù)顯得尤為重要，小標(biāo)本是指直徑小于0.3 cm，或者長(zhǎng)度小于2 cm的組織，包括經(jīng)內(nèi)鏡獲取的黏膜組織，淺表或深在部位的穿刺物，子宮腔刮取物，經(jīng)微創(chuàng)手術(shù)由器官或腫瘤中切取的不完整組織等?，F(xiàn)將制作流程及注意事項(xiàng)介紹如下。

1 材料和方法

1.1 設(shè)備和材料

1.1.1 設(shè)備

石蠟切片機(jī)（德國(guó)LEICA2235）、組織包埋機(jī)（日本櫻花）、組織漂烘儀、恒溫烤箱50℃

1.1.2 組織來(lái)源

我院病理科所接收到的包括腎穿刺組織、胃腸鏡活檢組織、支氣管鏡活檢組織、肝穿刺組織、乳腺穿刺組織、皮膚活檢組織及其他小組織。

1.1.3 試劑

10%的中性福爾馬林固定液、乙醇、二甲苯、石蠟（58～60℃）、蘇木素、伊紅。

1.2 方法

1.2.1 取材

用活檢鉗將小塊活檢組織放到專用的防漏濾膜紙上，包好置于已經(jīng)編輯好病理號(hào)的塑料包埋盒內(nèi)，然后放入生理鹽水5～10分鐘。

1.2.2 固定

取材工作結(jié)束后，將核對(duì)好數(shù)目的取材塊放入10%的中性緩沖福爾馬林固定液中進(jìn)行補(bǔ)充固定，直接在固定液中加人2‰的伊紅染液，經(jīng)過(guò)這樣經(jīng)過(guò)補(bǔ)充固定，使得組織被染成伊紅色，伊紅染料著色鮮艷持久，在包埋、切片、染色整個(gè)過(guò)程中，標(biāo)本容易識(shí)別，避免了漏取、丟失、 切片不全及過(guò)切等問(wèn)題，極大的提高了工作效率[1]。

1.2.3 脫水

脫水前先將梯度濃度的酒精放置到50℃的恒溫烤箱進(jìn)行加熱，然后將固定好的標(biāo)本分別放入75%乙醇5分鐘，85%乙醇5分鐘，95%乙醇I中5分鐘，9%乙醇II中5分鐘，無(wú)水乙醇I 3分鐘，無(wú)水乙醇II 3分鐘，二甲苯I和二甲苯II各1分鐘，浸蠟10分鐘。

1.2.4 包埋

用加熱的鑷子將組織有序的平整的放入包埋模具中，注意組織緊密集中但不可重疊，大小組織應(yīng)該放在同一個(gè)平面上，用手將模具移至小冷臺(tái)上，待石蠟將組織凝固后抽出鑷子，蓋上脫水盒，從側(cè)面輕輕加足量石蠟移至大冷臺(tái)上。

1.2.5 切片

將蠟塊放在冰盒上以利切片，切片厚度為3～4微米，組織較小時(shí)應(yīng)連續(xù)切片以免遺漏，將切片貼敷在載玻片上，連續(xù)切片不能少于8～10張。

1.2.6 染色

將切片分別放入二甲苯I、II、III中5分鐘，然后進(jìn)入由高到低的梯度乙醇各1分鐘，自來(lái)水沖洗，蘇木素染液5分鐘，自來(lái)水沖洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，伊紅水溶染液1～3分鐘，適度自來(lái)水沖洗返藍(lán)，再然后分別進(jìn)入由低到高的梯度濃度乙醇各30秒，后進(jìn)入二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

2 結(jié) 果

經(jīng)此方法處理過(guò)的組織蠟塊硬度適中，切片完整薄厚適中，細(xì)胞核與胞質(zhì)著色明顯，組織細(xì)胞無(wú)重疊擠壓，細(xì)胞形態(tài)完好，顏色對(duì)比鮮明，可用于后續(xù)的免疫組化和分子病理學(xué)的檢查。

3 討 論

（1）使用上述手工脫水方法大約需要3小時(shí)就可以完成快速制片，與常規(guī)機(jī)器脫水制片方法（大約需要12小時(shí)）相比極大的提高了工作效率，為次日診斷報(bào)告的及時(shí)發(fā)出提供了技術(shù)支持。

（2）穿刺及內(nèi)窺鏡活檢標(biāo)本多有擠壓，為避免這一現(xiàn)象，盡可能使組織恢復(fù)原有形態(tài)，可以在取得標(biāo)本后立即放在生理鹽水中浸泡5～10 min，讓組織自然舒展，生理鹽水加入10%中性緩沖甲醛固定劑[2]。

（3）組織固定時(shí)一定要保證固定液的新鮮，固定液要足量，一般要求在組織體積的10～20倍，固定時(shí)間為1～12小時(shí)。

（4）標(biāo)本接受和標(biāo)本取材時(shí)需認(rèn)真核對(duì)每例送檢標(biāo)本的編號(hào)，編碼，姓名與申請(qǐng)單是否一致，認(rèn)真檢查標(biāo)本瓶固定液是否滿意，杜絕張冠李戴式的錯(cuò)誤，取材結(jié)束后也應(yīng)再次核實(shí)取材內(nèi)容、組織塊數(shù)以及編號(hào)編碼，并在病理檢查申請(qǐng)單上簽名和簽署日期，防止醫(yī)療事故的發(fā)生。

（5）取材時(shí)對(duì)于直徑小于0.3 cm的組織推薦使用市售的細(xì)小標(biāo)本取材用包埋紙包裹，該包埋紙?jiān)诮M織脫水浸蠟過(guò)程中不易粘粘，易分離，包裹時(shí)包埋紙不要整齊對(duì)折，這樣有利于包埋時(shí)打開(kāi)，同時(shí)防止小組織在脫水過(guò)程中從包埋盒的小孔中漏掉。

（6）組織脫水時(shí)乙醇的濃度應(yīng)為低濃度到高濃度逐漸遞增，起始濃度為70～75%為宜，實(shí)踐證明70～75%乙醇對(duì)組織的通透性最佳，可以減緩組織快速過(guò)度的皺縮，有利于組織的脫水。加溫脫水時(shí)恒溫烤箱的溫度不易超過(guò)50攝氏度，溫度過(guò)高雖然可以縮短組織脫水的時(shí)間，但是會(huì)使組織過(guò)度收縮組織變硬造成切片困難。

（7）石蠟包埋首先是對(duì)所使用的石蠟的選擇，過(guò)硬的組織應(yīng)該選擇較高硬度的石蠟包埋，較軟的組織應(yīng)該選擇較低硬度的石蠟包埋。包埋時(shí)石蠟的溫度過(guò)高會(huì)將組織燙壞，造成組織變硬、變脆，發(fā)生彎曲變形最終影響切片質(zhì)量，一般蠟缸的溫度應(yīng)高出石蠟的熔點(diǎn)4～6℃。定期清理石蠟中包埋時(shí)帶入水份和氣泡，以免包埋時(shí)過(guò)多的空氣和雜質(zhì)帶到組織蠟塊中。多塊大小不等的組織在同一蠟塊包埋時(shí)，組織應(yīng)緊密排列，同時(shí)注意間距不宜過(guò)小，以免造成組織重疊。包埋時(shí)包埋盒或包埋器皿表面石蠟?zāi)Y(jié)成蠟?zāi)r(shí)才能將組織蠟塊移至冷水或冷臺(tái)上進(jìn)行冷卻，如果速度過(guò)快會(huì)使蠟塊產(chǎn)生龜裂，同樣影響切片質(zhì)量。

（8）切片前先將包埋好的蠟塊放入冰箱里冷凍10分鐘，或者按排列好的順序把組織塊放到冷卻裝置上，使得組織蠟塊溫度降低，適度硬化，這樣有利于切片。用鋒利的刀切片可以保證連切，使成帶狀。先進(jìn)行粗切直到組織完全暴露，然后進(jìn)行細(xì)切直到組織塊表面均勻無(wú)白點(diǎn)后再進(jìn)行展片，連切出多個(gè)切面，以防切片不全，這樣可以找到最嚴(yán)重的病變，以防漏診，2次展片、撈片使切片充分展開(kāi)以防折疊，便于觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，也可防止脫片[3]。

（9）石蠟切片時(shí)要調(diào)整好切片機(jī)刀架的角度，一般為20°～30°，刀刃的角度為5°～10°，合適的刀架角度和刀刃角度可以很好的保護(hù)刀刃，使得刀刃長(zhǎng)久的保持鋒利的狀態(tài)。

（10）石蠟切片時(shí)應(yīng)加裝霧化器，霧化器的使用可以起到濕潤(rùn)蠟塊和去除靜電的作用，霧化器的位置應(yīng)與組織蠟塊保持2-3cm的距離，風(fēng)速和出霧量調(diào)整到恰到好處。

（11）撈片時(shí)一般撈片機(jī)內(nèi)水的溫度應(yīng)調(diào)節(jié)至45℃左右恒定，溫度過(guò)高會(huì)使組織蠟片融化，溫度過(guò)低則組織蠟片不易展開(kāi)，容易產(chǎn)生氣泡。保持撈片機(jī)內(nèi)水面的清潔，防止污染切片。

（12）染色時(shí)常常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核染色蒼白暗淡，出現(xiàn)這種情況的原因一般為切片在蘇木精染液停留的時(shí)間過(guò)短，蘇木精使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)喪失染色能力，鹽酸乙醇分化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。伊紅染色后在酒精中停留時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)榫凭珜?duì)伊紅染液有分化的作用，容易造成伊紅的退色現(xiàn)象。

（13）染色中經(jīng)常會(huì)發(fā)生組織切片脫落的情況，常見(jiàn)原因?yàn)榻M織固定脫水透明欠佳，組織切片過(guò)厚，染色時(shí)脫蠟結(jié)束后流水沖洗組織切片過(guò)度，使得組織切片與載玻片分離。

（14）封片時(shí)一般選擇中性樹(shù)膠為封固劑，因?yàn)橹行詷?shù)膠可以被二甲苯稀釋，其折光率與載玻片的折光率相近，其濃度也要調(diào)整適中，染色結(jié)束后在留有少量二甲苯的切片上滴加2滴黃豆大小的中性樹(shù)膠，略微傾斜載玻片，同時(shí)將蓋玻片輕輕放在組織載玻片上面，這樣做可以防止封片時(shí)氣泡的產(chǎn)生。推薦使用全自動(dòng)組織切片封片機(jī)。

（15）染色時(shí)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)染色不均勻，染色背景不分明，染色背景臟掉片的情況，主要原因還是脫蠟不徹底，所以在染色前烤片時(shí)間必須適當(dāng)延長(zhǎng)，一般在30分鐘以上，溫度應(yīng)控制在65℃左右，染色前蘇木素必須去除表面形成的氧化膜，鹽酸乙醇分化要恰到好處，保證每步試劑的純度，定期更換試劑。所以想要得到理想的染色效果必須使用一套合理的適合自己的染色程序。

（16）HE染色的關(guān)鍵步驟時(shí)鹽酸乙醇的分化和返藍(lán)，鹽酸乙醇的濃度應(yīng)為1%，分化時(shí)當(dāng)切片上的組織顏色由原先的深藍(lán)色逐漸變成粉紅色時(shí)就說(shuō)明分化程度已經(jīng)適中，應(yīng)當(dāng)終止分化，然后流水沖洗返藍(lán)。

綜上所述，病理科小活檢標(biāo)本制作方法過(guò)程繁瑣，經(jīng)過(guò)我院多年工作實(shí)踐及病理科前輩經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如上，如上方法制作的病理切片質(zhì)量滿意，最終保證了病理診斷的及時(shí)準(zhǔn)確，同時(shí)也為患者減少了就診時(shí)間，希望此方法能給病理同行借鑒。