晚期非小細(xì)胞肺癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)及臨床意義

茍小麗 苑成 柏玉舉 石磊 邢時(shí)云 馬虎

(1遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000；2遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 遵義市第一人民醫(yī)院)

肺癌是我國(guó)目前發(fā)病率和死亡率均居高不下的惡性腫瘤，近年來相關(guān)調(diào)查顯示，肺癌是發(fā)病率和死亡率均排名第一的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人們身體健康〔1〕。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致晚期肺癌患者死亡的重要原因〔2〕。惡性腫瘤難以被治愈的重要原因在于腫瘤微轉(zhuǎn)移灶難以被徹底清除，造成腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。血行播散是腫瘤細(xì)胞主要的轉(zhuǎn)移途徑之一。循環(huán)腫瘤細(xì)胞是進(jìn)入外周血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，與惡性腫瘤血行播散的發(fā)生密切相關(guān)〔3〕。目前臨床已經(jīng)逐步開始將循環(huán)腫瘤細(xì)胞測(cè)定應(yīng)用于腫瘤的早期診斷中〔4〕。本研究探討晚期非小細(xì)胞肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的測(cè)定及其意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月到2018年12月晚期非小細(xì)胞肺癌患者38例為病例組，男22例，女16例，年齡42～73〔平均(64.61±7.13)〕歲，ⅢA期5例，ⅢB期13例，Ⅳ期20例。選取同期收治的肺部良性病變患者30例為對(duì)照組，男16例，女14例，年齡38～72〔平均(59.77±8.04)〕歲，17例為肺部感染，7例為支氣管哮喘，5例為慢性阻塞性肺疾病，1例為慢性支氣管炎。兩組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 參照《中國(guó)晚期原發(fā)性肺癌診治專家共識(shí)(2016年版)》〔5〕進(jìn)行診斷。病例組均根據(jù)臨床癥狀、肺部CT及磁共振成像(MRI)檢查，并經(jīng)病理檢查，確定診斷為晚期非小細(xì)胞肺癌。同時(shí)排除預(yù)期生存時(shí)間<3個(gè)月及入院前已經(jīng)接受化療、放療等抗腫瘤治療的患者；排除合并其他原發(fā)性惡性腫瘤病史的患者；排除合并肝腎衰竭等其他嚴(yán)重內(nèi)科疾病的患者；排除拒絕或者不能耐受化療等不能配合完成本研究干預(yù)措施的患者。兩組均簽署知情同意書，且本研究在經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施。

1.3研究方案 兩組均于肘正中靜脈處采集外周靜脈血作為檢測(cè)標(biāo)本。采集標(biāo)本時(shí)注意將穿刺后的前2 ml棄去后，采集隨后的7.5 ml靜脈血加入肝素混勻后送檢。富集腫瘤細(xì)胞采用密度梯度離心法，將標(biāo)本與等量磷酸鹽緩沖液混勻后，以2∶1比例加入細(xì)胞分離液層面上。經(jīng)離心處理后，將環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層吸出，并在磷酸鹽緩沖液中洗滌2次后，再次進(jìn)行離心處理。完成腫瘤細(xì)胞富集后，在載玻片上均勻涂上單個(gè)核細(xì)胞懸液，室溫下靜置30 min，然后以4%多聚甲醛將抗原固定，10 min后以磷酸鹽緩沖液進(jìn)行3次洗滌，每次5 min。以0.1%Triton X-100通透胞膜，15 min以磷酸鹽緩沖液進(jìn)行3次洗滌，每次5 min。5%牛血清清蛋白封閉，30 min后以磷酸鹽緩沖液進(jìn)行3次洗滌，每次5 min。以小鼠抗人Pan-細(xì)胞角蛋白(購(gòu)自上海田源生物技術(shù)有限公司)滴加后，4℃過夜后以磷酸鹽緩沖液進(jìn)行3次洗滌，每次5 min。滴加FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫下孵育，2 h后以磷酸鹽緩沖液進(jìn)行3次洗滌，每次5 min。以7 μl 4，6-二脒基-2-苯基吲哚(北京索萊寶科技有限公司)滴于細(xì)胞區(qū)中后，蓋上玻片封固。以免疫熒光顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察并照相。陽(yáng)性對(duì)照為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的肺腺癌A549細(xì)胞株(購(gòu)自北京天沃科技發(fā)展有限公司)，磷酸鹽緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照。循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕為：圓形、橢圓形或者長(zhǎng)形細(xì)胞，核質(zhì)明顯大于血細(xì)胞，熒光下的細(xì)胞形態(tài)完整，且同時(shí)染藍(lán)色和綠色熒光。光鏡下尖刀細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核均完整。外周血見單個(gè)核細(xì)胞為陰性對(duì)照。

1.4療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)〔7〕(RECIST)，以完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進(jìn)展(PD)進(jìn)行評(píng)價(jià)。病例組患者化療前、化療2個(gè)周期后行循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)，緩解(RR)：化療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)較化療前減少1個(gè)以上；SD：化療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)與化療前相同；PD：化療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)較化療前增加1個(gè)以上〔8〕。

1.5觀察指標(biāo) 比較兩組循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)陽(yáng)性率；比較病例組循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性和陰性患者的相關(guān)臨床資料；收集病例組相關(guān)臨床資料(年齡、性別、吸煙史、腫瘤的病理學(xué)特征等)；比較病例組化療前后循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性率；分析RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)晚期非小細(xì)胞肺癌化療效果的相關(guān)性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行Fisher確切概率法、χ2檢驗(yàn)和列聯(lián)表分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率比較 病例組循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率為60.53%(23/38)，顯著高于對(duì)照組〔0.00%(0/30)，P<0.05〕。

2.2病例組化療前后循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率比較 病例組化療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率為34.21%(13/38)，顯著低于化療前〔60.53%(23/38),P<0.05〕。

2.3病例組循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性和陰性患者相關(guān)臨床資料比較 循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性患者病理學(xué)分期Ⅳ期比例顯著高于循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性患者(P<0.05)；兩組年齡、性別、吸煙史、組織學(xué)類型、分化程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 病例組循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性和陰性患者相關(guān)臨床資料比較〔n(%)〕

2.4RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的比較 晚期非小細(xì)胞肺癌化療療效采用RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且上述兩種療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有一定程度的吻合(κ=0.561)；相關(guān)分析結(jié)果顯示，循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)與晚期非小細(xì)胞肺癌的化療效果呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.442，P<0.05)，見表2。

表2 RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)比較(n)

3 討 論

近年流行病學(xué)研究顯示，肺癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率均呈上升的趨勢(shì)，同時(shí)也是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，肺癌的防治形勢(shì)十分嚴(yán)峻〔9〕。晚期非小細(xì)胞肺癌治療的難點(diǎn)之一在于處理腫瘤的轉(zhuǎn)移病灶。循環(huán)腫瘤細(xì)胞是原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶之外的腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞侵襲進(jìn)入血液循環(huán)后，可隨血循環(huán)侵襲機(jī)體其他臟器而產(chǎn)生其他轉(zhuǎn)移病灶。因此，監(jiān)測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞有利于更早地發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移情況和評(píng)估臨床治療的效果。

在本研究中，晚期非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)陽(yáng)性率為60.53%，這與孫霞等〔10〕的研究結(jié)果基本一致。同時(shí)，對(duì)照組患者無病例檢出循環(huán)腫瘤細(xì)胞，這說明本研究所采用的檢測(cè)方法檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有較高的特異性。本研究結(jié)果說明化療可在一定程度上清除外周血循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞。化療過程中監(jiān)測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞也有利于評(píng)估化療方案的有效性，對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床治療有一定的指導(dǎo)意義。馮倩等〔11〕的研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展期胃癌化療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞降低的患者無進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，證實(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞有助于評(píng)估化療的有效性。

肺癌通過血液循環(huán)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提是腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)中。臨床研究顯示，循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性與惡性腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、患者的預(yù)后有顯著的相關(guān)性〔12，13〕。本研究結(jié)果也說明了循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性是晚期非小細(xì)胞肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，與腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。龔福生等〔14〕的研究發(fā)現(xiàn)，隨著乳腺癌患者TNM分期的升高，循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率顯著升高，說明循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)有助于評(píng)估惡性腫瘤患者的臨床分期，進(jìn)而判斷患者的預(yù)后。

本研究RECIST評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)在評(píng)估晚期非小細(xì)胞肺癌化療療效方面有一定的吻合度。這說明循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌的療效評(píng)估價(jià)值與RECIST相當(dāng)，這也在一定程度上反映了循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)的檢測(cè)可用于晚期非小細(xì)胞肺癌的療效評(píng)估。同時(shí)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)與晚期非小細(xì)胞肺癌的化療效果呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這說明化療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目的變化反映了化療的效果。邊莉等〔15〕的研究發(fā)現(xiàn)，化療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目<5個(gè)/7.5 ml患者的無進(jìn)展生存時(shí)間與基線循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目<5個(gè)/7.5 ml患者的無進(jìn)展生存時(shí)間相當(dāng)，且均長(zhǎng)于化療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目≥5個(gè)/7.5 ml患者，這說明動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)乳腺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目對(duì)腫瘤的進(jìn)展有預(yù)測(cè)作用。