結直腸癌Visfatin、MMP-14的表達及意義

榮瑋 徐晨 李雪松 劉婷 于秀文

(齊齊哈爾醫學院病理學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

隨著人們生活水平的提高及相應生活方式的改變，結直腸癌(CRC)的發病率逐步增加。而在CRC的發病危險因素中，肥胖具有明顯的獨立性〔1〕。內脂素(visfatin)是新近發現的一種脂肪細胞因子具有類胰島素作用、促炎、促進脂肪組織分化和合成等多種生物學活性，血漿水平升高是中國患者早期和晚期CRC的一個重要危險因素〔2〕。基質金屬蛋白酶(MMP)-14是MMPs家族第一個被發現的膜型MMP，是影響腫瘤細胞轉移及腫瘤進展的重要蛋白酶〔3〕。visfatin、MMP-14通過磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途徑，參與肺癌細胞生長、轉移及血管生成等病理生理過程〔4～6〕，二者在CRC組織中是否存在相互關聯尚待證實。本研究應用RT-qPCR技術和免疫組化技術檢測 visfatin、MMP-14在CRC組織中不同水平的表達，將二者與CRC臨床病理因素的關系和相關性進行分析，從而探討其在CRC侵襲、轉移中的作用，為CRC的診斷和靶向治療提供依據。

1 資料與方法

1.1標本來源 2015～2017年齊齊哈爾醫學院附屬醫院根治性切除術的CRC原發病例64例患者的新鮮手術切除標本為觀察組，術前均未經任何系統的放療和化療。對照組為對應遠切端正常組織64例〔距癌邊緣>5 cm，后經蘇木素-伊紅(HE)證實無癌組織浸潤〕。在不影響正常臨床病理檢驗的前提下立即在無菌操作下一次取材適量的新鮮疑似癌組織標本，并標記好患者信息，在肉眼觀典型病變位置取10 mg放入RNase Free EP管內，30 min內放入-80℃超低溫冰箱冷凍儲存，剩余部分10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色證實均為CRC，與臨床病理診斷相符。男44例，女20例；發病年齡60歲以下的27例，60歲以上含60歲37例；發生部位結腸24例，直腸40例；腫瘤最大直徑<5 cm 31例，≥5 cm 33例；根據結直腸腸腺癌的組織學形態及分化程度可分為：高中分化36例，低分化28例；浸潤<肌層27例，浸潤≥肌層37例；無淋巴結轉移者23例，有淋巴結轉移者41例; TNM分期中Ⅰ期7例，Ⅱ期17例，Ⅲ期36例，Ⅳ期4例。

1.2主要試劑 TAKARA公司PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒及TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus) RT-PCR試劑盒分別進行反轉錄和目的片段的擴增。visfatin正義鏈5′-TGCCTTCGGTTCTGGTGGAGGTT-3′;visfatin反義鏈5′-ACAAAATTCCCTGCTGGCGTCCT-3′ ;MMP-14正義鏈5′-GGAACCGTGTAGCTTTGTGTCTGTC-3′；MMP-14反義鏈5′-TGAGGGTCCTGCCTTCAAGTG-3′；GAPDH正義鏈5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′；GAPDH反義鏈5′-GAGATGGTGATGGGATTTC-3′；鼠抗人visfatin 、MMP-14多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，工作液濃度為1∶600，免疫組織化學試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色液為福州邁新生物技術公司產品。

1.3實驗方法

1.3.1RT-qPCR檢測 取-80℃保存的新鮮組織標本按Trizol試劑盒說明抽提組織總RNA，紫外分光光度法評估RNA的純度，A260/A280 的比值在1.8～2.1，總RNA樣品置-80℃保存備用。按照cDNA 反轉錄反應試劑盒說明書進行反轉錄來獲得所需cDNA置-80℃保存待檢。按 RT-qPCR試劑盒的操作步驟，進行 PCR 的擴增反應，PCR反應液在冰上進行配制，反應的體系20 μl，測定visfatin mRNA和MMP-14 mRNA的表達，GAPDH 作為內參，根據各目的基因的 CT 值，用 2-ΔΔCt法比較CT值。

1.3.2免疫組織化學法 切片常規脫蠟，水化后，3%過氧化氫(H2O2)-甲醇封閉內源性過氧化物酶20 min，枸櫞酸高壓修復10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3×3 min，一抗4℃冰箱過夜，第2天切片恢復室溫后，依次滴加試劑A：反應增強液，試劑B：酶標抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫各孵育15 min，中間PBS洗3×3 min，DAB顯色，蘇木素復染。以PBS代替一抗作陰性對照。采用半定量積分法判定結果，顯色度按細胞著色深淺計分：0分基本無著色;1分淺黃;2分淺棕，3分深棕。根據陽性細胞所占百分比計分，無陽性細胞為0分;陽性細胞<10%為1分;陽性細胞10%～50%為2分;陽性細胞51%～75%為3分;陽性細胞>75%以上為4分。

1.4統計學方法 使用SPSS25.0 軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1visfatin mRNA和MMP-14 mRNA的表達情況 visfatin mRNA在觀察組和對照組中的相對表達水平分別為4.315 3±2.478 51和1.010 0±0.891 55，兩組間差異有顯著性意義(P<0.01)。MMP-14 mRNA在觀察組和對照組中的相對表達水平分別為3.937 2±2.482 67和0.911 2±0.938 74，兩組間差異有顯著性意義(P<0.01)。

2.2visfatin mRNA和MMP-14 mRNA表達的相關性分析 visfatin mRNA和MMP-14 mRNA呈顯著正相關(r=0.758，P<0.01)。見圖1。

2.3visfatin和MMP-14 免疫組化的表達情況 visfatin免疫組化陽性產物呈棕褐色顆粒狀位于細胞核和細胞質。visfatin在對照組、觀察組的陽性率分別為29.7%(19/64)、67.2%(43/64)，兩組比較具有統計學意義(P<0.001)。MMP-14免疫組織化學陽性產物呈棕褐色顆粒狀位于細胞膜和細胞質，在正常腸黏膜不表達或表達較弱，在癌組織和間質中彌漫分布強表達或僅在間質強表達，見圖2。MMP-14在對照組和觀察組的陽性率分別為17.2%(11/64)、62.5%(40/64)，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖2 免疫組化檢測兩組visfatin、MMP-14表達(×200)

2.4visfatin與MMP-14表達與結直腸癌的臨床病理因素的關系 visfatin和MMP-14的表達與患者年齡、性別和腫瘤部位、大小無相關性，與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有關(P<0.05)。見表1。

表1 結直腸癌患者visfatin與MMP-14表達與臨床病理因素的關系(n)

2.5visfatin與MMP-14在結直腸癌組織中表達的相關性 visfatin和MMP-14在結直腸癌組織中的表達呈顯著正相關(P<0.01)，見表2。

表2 visfatin與MMP-14在結直腸癌組織中表達的相關性

3 討 論

近年來研究發現，脂肪組織不再只是一種沉默的能量儲存器官，僅用來評估人體營養狀況，也是一種很重要的內分泌器官，分泌多種具有活躍生物學活性的物質，如visfatin、瘦素、脂聯素、抵抗素等，這些物質統稱作脂肪細胞因子。visfatin與煙酰胺磷酸核糖轉移酶(Nampt)、前B細胞集落增強因子(PBEF)具有相同結構的同一蛋白質分子。人類該相關基因位于第7號染色體，長約37.41 kb，含11個外顯子和10個內含子，可編碼473個氨基酸，是一類具有類胰島素作用、促炎、促進脂肪組織分化和合成等多種生物學活性的脂肪細胞因子，廣泛表達于體內多種組織器官。visfatin在胃癌的研究〔7〕顯示，抵抗素和visfatin協同促進胃癌細胞的生長。乳腺癌組織visfatin、淋巴結轉移、腫瘤分期、年齡和腫瘤大小，被確定為高度相互作用并與乳腺癌進展相關。子宮內膜癌高visfatin血清水平預測子宮內膜癌患者預后差。visfatin水平上升與CRC發病風險相關，與疾病惡化程度和腫瘤分期也有關〔8～10〕。

MMP-14基因組定位于14q11，全長大于10 kb，由10個外顯子和9個內含子組成，編碼582個氨基酸。MMP-14可以通過激活MMP-2、MMP-9、MMP-13等，降解腫瘤細胞周圍的間質成分，還可以直接降解腫瘤間質中的如玻璃黏連蛋白、層黏連蛋白-1、和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原等成分，涉及到多種生物的細胞外基質的降解過程和加速血管生成，被認為是影響腫瘤細胞轉移及腫瘤進展的重要蛋白酶。MMP-14在肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中表達的量和強度均上調，并和惡性腫瘤的臨床 TNM 分期、病理分化程度、淋巴結轉移關系密切〔11，12〕。

本研究通過基因水平和蛋白水平證實visfatin和MMP-14在CRC中高表達，且與CRC的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有關。說明二者在CRC的侵襲、轉移中發揮重要作用。Adya等〔13〕發現visfatin能促進內皮細胞表達、MMP-2，MMP-9增多，導致內皮功能紊亂和新生血管的形成。MMP-14在對MMP-2進行有效活化的同時又反作用于 MMP-14，使 MMP-14表達明顯增高，形成環式循環，進而促進腫瘤離開原發部位發生轉移〔14，15〕，此種作用使腫瘤轉移潛能大大增加。PI3K/Akt通路具有激活MMP-14和MMP-2促進腫瘤血管生成擬態，visfatin通過AKT/PI3K和細胞外信號調節激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活誘導乳腺癌細胞增殖，并對細胞凋亡具有保護作用〔4〕。骨關節炎患者其visfatin濃度較高，且與Ⅱ型膠原蛋白的降解產物呈正相關，表明visfatin參與軟骨基質的降解，其中重要一點是visfatin促進軟骨細胞表達MMP-14降解軟骨基質Ⅱ型膠原所需酶類〔16〕。綜上所述，visfatin與MMP-14功能上相互影響，但目前還沒有在CRC組織中關于二者相關性的報道。本研究在基因水平和蛋白水平還研究了二者的相關性，發現二者在結直腸癌存在明顯的相關性，visfatin的上調影響MMP-14的表達。上述關于二者相互作用的機制是否存在于CRC中尚待研究。二者參與機體多種生理和病理進程，在腫瘤、心血管疾病、炎癥相關疾病、中樞神經系統疾病和骨關節疾病中的作用已受到重視。進一步深入了解二者的相互關系及相互作用機制將有助于疾病的診斷和靶向藥物的研究，具有一定的醫學價值。