瑞芬太尼預處理對腦缺血再灌注損傷老年大鼠血小板衍生因子、髓鞘堿性蛋白表達的影響

劉姝 周金鳳 曾憲晶 祝美珍 俞睿

(井岡山大學附屬醫院 1麻醉科，江西 吉安 343000；2中醫科；3廣西中醫藥大學基礎醫學院)

腦血管疾病目前已經成為中國中老年人群致死、致殘的主要疾病之一，其中缺血性腦卒中最為突出，約占腦血管疾病的70%〔1〕。而腦缺血再灌注(I/R)損傷則是缺血發生一定時間后再次恢復血流灌注，但在多數情況下，缺血后再灌注不僅沒有使腦組織功能恢復，反而進一步加重缺血導致的結構破壞和功能障礙〔2〕，是引起腦血管病惡化的重要機制之一，有效干預I/R損傷是防治腦損傷進一步加劇的重要環節。研究證實〔3～5〕，使用瑞芬太尼預處理的動物可有效減輕心、肝、腎等器官再灌注損傷程度，其中關于腦I/R保護的相關機制鮮有報道，有研究表明〔6，7〕瑞芬太尼預處理與腦保護之間存在相互關系，但未進一步述及具體機制。本實驗觀察瑞芬太尼預處理對I/R損傷大鼠腦組織血小板衍生因子(PDGF)、髓鞘堿性蛋白(MBP)表達的影響并分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1試驗動物與造模方法 健康SPF級SD大鼠50只，15～24月齡，隨機分為空白組5只，假手術組、腦I/R組、瑞芬太尼預處理組各15只，體重(350±50)g，從廣西醫科大學動物實驗中心購入(生產許可證號：SCXK桂2003-0003，使用許可證號：SYSK桂2003-0005)，在本校動物實驗房適應性喂養1 w后，參照longa法〔8〕制備大鼠中腦動脈閉塞(MCAO)模型，術后2 h拔出栓線約10 mm，恢復血流，制成大鼠急性腦I/R損傷模型。造模成功后以上各組按術后2 h I/R不同處死時間點6 h、12 h、24 h分為3個亞組，每組5只。假手術組：僅行左側頸總動脈分離，未行插線不結扎也不做缺氧缺血處理。瑞芬太尼預處理組：在行MCAO手術前2 h經股靜脈注入瑞芬太尼(人福醫藥公司，批號：6180309)，給藥劑量參照文獻〔9〕中大鼠換算的標準方程計算，每次輸注5 min，連續3次，輸注速率為1.0 μg/(kg·min)，每次輸注完后給予5 min間歇期，整個預處理過程約30 min。I/R組：操作步驟同瑞芬太尼預處理組，輸注等量生理鹽水代替瑞芬太尼。大腦MCAO模型制作成功的標準：①患側右前爪部分屈曲或完全屈曲；②行走時身體向偏癱側轉圈；③行走時身體向偏癱側跌倒。

1.2采樣制作 大鼠予10%水合氯醛麻醉后固定，剪開胸腹腔，暴露心臟，通過心臟快速灌注約100 ml生理鹽水，灌洗至肺臟變白，右心耳流出清亮液體后，再灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS)約150 ml固定，至大鼠尾巴及四膚強直僵硬后，撬開顱骨，完整取腦放入生理鹽水中漂洗殘血后，置于4% PBS中固定。24 h后腦組織取出切塊，經不同梯度酒精脫水，浸蠟，石蠟包埋，用切片機制作約4 μm厚度的冠狀切片，常規HE染色后，光鏡下觀察缺血側腦組織神經細胞形態病理變化。

1.3指標檢測 免疫組化操作步驟：取出上述包埋切片脫蠟，檸檬酸熱修復10 min，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶20 min；封閉血清37℃中水浴30 min，滴加山羊血清50 μl/片，37℃封閉內源性生物素20 min；滴加一抗1∶100，50 μl/片，40℃20 h；滴加生物素標記的二抗50 μl/片，室溫30 min；滴加堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素50 μl/片，37℃ 30 min；上述每步驟間均用PBS漂洗5 min×3次，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。在10×40倍光鏡下觀察胞質有棕色顆粒者為陽性細胞，每張切片隨機選取觀察5個視野，計算陽性細胞數，取平均值。

1.4統計方法 采用SPSS19.0軟件，成組設計多樣本均數的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA檢驗)，多樣本均數組間比較用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1HE染色結果 空白組、假手術組：大鼠神經元形狀完整，多層密集排列，胞膜呈圓或橢圓形，核仁明顯，核染色質清晰均勻。I/R組：鏡下神經細胞數目減少，再灌注6 h時胞體腫脹，排列不齊，局部缺血周圍區水腫明顯，細胞腫脹，疏松淡染；再灌注24 h時神經元壞死和凋亡明顯，水腫、腫脹減輕，胞體縮小，見大量固縮變性壞死神經細胞，細胞核消失，部分區域核固縮深染，邊緣區炎性細胞浸潤，胞質內形成微空泡，膠質細胞增生。瑞芬太尼預處理組再灌注6 h時細胞多層密集，胞膜較完整，水腫不明顯，再灌注24 h時神經元部分胞體縮小，色深染，周圍見少量固縮壞死神經元，炎性細胞浸潤及少量膠質細胞增生，較I/R組病理改變減輕。見圖1。

2.2神經功能缺損評分 MCAO術后，空白組與假手術組神經功能評分均無明顯改變(P>0.05)。I/R組和瑞芬太尼預處理組在術后均出現不同程度的神經功能缺損癥狀，與I/R組相比，瑞芬太尼預處理組神經功能缺損評分減輕(P<0.05)，見表1。

表1 各組腦I/R各時間點神經功能缺損評分(分，

與空白及假手術組比較：1)P<0.01；與I/R組比較：2)P<0.05

2.3PDGF、MBP陽性細胞表達 MCAO術后，與空白組、假手術組、I/R組比較，瑞芬太尼預處理組PDGF陽性細胞表達在各時間點均明顯升高(P<0.01)，I/R組PDGF陽性細胞表達與空白組、假手術組相比無顯著差異性(P>0.05)。I/R組MBP陽性細胞表達數其他與各組比較明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組I/R各時間點PDGF、MBP陽性細胞數表達(個/視野，

與瑞芬太尼預處理組比較：1)P<0.01;與I/R組比較：2)P<0.01，3)P<0.05

3 討 論

瑞芬太尼作為一種新型的超短效型阿片受體激動劑，是麻醉和鎮痛中常用藥物，已在臨床廣泛應用，作為神經傳遞素的抑制劑，易透過血腦屏障，快速達到血-腦平衡，藥物吸收后廣泛分布于整個中樞神經系統，為腦損傷治療提供藥動學基礎。腦缺血發生后，隨著氧自由基大量釋放、鈣超載及谷氨酸受體激活等各種因素相互作用下，激活細胞凋亡轉導通路，最后導致細胞死亡〔10〕。在腦損傷過程中，MBP作為抗原激活免疫系統，缺血性腦損傷引起中樞神經系統髓鞘斷裂崩解，MBP釋放可誘導炎癥反應的發生〔11〕，啟動炎癥損傷級聯反應程序，隨著血流再灌注，神經細胞損傷進一步加重，加速細胞凋亡。研究表明MBP對神經元的神經毒性作用主要是由其強堿性決定的，這種強堿性使得MBP可以廣泛結合于神經元膜表面，從而直接損傷神經元質膜，造成離子紊亂及細胞內容物外漏，離子穩態失衡，最終導致神經元凋亡〔11〕。研究〔12〕證實其過量表達與神經損傷呈正相關。MBP 表達水平反映了中樞神經系統有無實質性損害，特別是有無髓鞘脫失的一個較為特異性的生化指標，其含量水平反映了損害范圍的嚴重程度〔13〕。本實驗瑞芬太尼預處理組MBP表達水平明顯低，其機制可能是通過減輕MBP表達水平來達到腦保護，與臨床報道一致〔14〕。

PDGF是一種具有分裂能力和對細胞有增殖作用的因子，主要對特定細胞群起刺激作用，并且可以促進有絲分裂，在控制細胞遷移分化方面有顯著意義。研究結果表明：PDGF-二聚體結構(BB)是針對PDGF受體-β的最高親和配體，能促進內皮細胞、平滑肌細胞、神經膠質細胞和纖維細胞增長和繁殖〔15〕。可加速細胞外基質蛋白和膠原蛋白的形成，促進損傷區修復。PDGF還是神經元及其角質細胞的重要生長因子，可以發揮營養神經、調節血管張力、促進血管生長等作用，在急性腦梗死患者康復治療中具有重要意義〔16〕。本實驗中瑞芬太尼預處理組腦組織PDGF含量增高，其原因可能與刺激腦組織細胞產生PDGF表達增加有關，有研究表明其通過介導磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路的激活發揮作用〔17〕。

綜上，瑞芬太尼在I/R早期可能通過干預炎癥損傷級聯反應程序，刺激神經細胞的遷移增殖分化，發揮營養神經、調節微血管生成作用。瑞芬太尼預處理可以減輕大鼠腦I/R損傷程度，減輕神經元壞死和凋亡，具有一定的神經保護作用。