MALDI質譜技術在酶活性分析中的應用

林 夕，玲 玲,國新華

(吉林大學 化學學院，吉林 長春 130012)

酶分子產生于活細胞，其是具有特異識別底物和催化功能性質的蛋白質或RNA分子，亦是一種極其重要的生物催化劑。人體和哺乳動物體內至少含有5 000種酶，在凝血過程、蛋白質代謝、組織再生和免疫防御等許多生物活動中扮演著重要角色[1-4]。酶活性的改變與糖尿病[5]、阿爾茲海默癥[6]、癌癥[7]、艾滋病[8]等許多疾病密切相關。酶活性抑制劑可以調控生物過程，用于疾病的治療，例如：人類免疫缺陷病毒(HIV)患者接受HIV-1蛋白酶抑制劑治療，可以抑制疾病的發展，延長壽命。因此，發展高靈敏、高效的酶活性檢測技術和方法，同時有效篩選酶活性抑制劑對于疾病的診斷和治療具有重要意義。

傳統的免疫分析法是通過檢測酶的濃度間接確定酶活性。由于酶的濃度并不能直接代表酶的活性，因此常出現假陽性結果[9-10]。針對底物設計的熒光探針，制備過程相對復雜，且光學信號易重疊，不適合多種酶的同時檢測[11-12]。質譜法是通過檢測酶的底物和產物在酶作用下的信號變化來監測酶活性，方法準確性更高，而且適合多種酶的同時檢測。近年來，利用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)技術將鑭系元素標記在多種蛋白酶底物上，應用于多種蛋白酶的測定，取得了滿意的結果[13-14]。液相色譜-串聯質譜(LC-MS)結合多反應監測(MRM)技術亦被用于定量描述酶活動,被認為是“金標準”方法[15-16]。與ICP-MS和LC-MS相比，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)具有樣品用量少、分析速度快、高耐鹽和高通量的優勢，在分析過程中可以簡化復雜樣品的分離、除鹽和標記步驟。MALDI質譜離子化和MALDI靶板的修飾及生物芯片技術相結合，可以實現微量樣品的在線分離和富集，以及高效的酶活性分析和藥物篩選。本文綜述了國內外利用MALDI-TOF MS檢測酶活性和藥物篩選的方法。這些方法主要分為兩類：一種是基于非均相酶催化反應，將酶的底物固定在固體表面上，此表面與溶液相中的酶進行反應，再用MALDI-TOF MS進行檢測；另一種是基于均相酶催化反應,即底物和酶在溶液相中反應，再用MALDI-TOF MS檢測底物和產物。兩種方法的原理示意圖如圖1所示。

圖1 酶活性分析方法示意圖

1 基于非均相酶催化反應

1.1 通過共價作用固定底物

Su等[17]在金基底上通過Au-S作用自組裝單分子層(SAMs)，此生物芯片非常適用于MALDI-TOF MS，因此稱為SAMDI(Self-assembled monolayers for desorption ionization)技術。如圖2[18]所示，馬來酰亞胺基團可與半胱氨酸殘基反應從而固定蛋白激酶底物多肽，而寡聚乙二醇的設計能有效地抑制單分子層與蛋白質之間的非特異性作用，確保單分子層只通過固定的配體與蛋白質進行特異性相互作用。這種多肽芯片可用MALDI-TOF MS表征。蛋白激酶活性通過底物肽和產物肽的信號來監測。不同蛋白激酶底物的氨基酸序列不同，因此在一個芯片上固定多種多肽底物，可同時分析多種蛋白激酶。此方法評價了激酶抑制劑濃度對于激酶催化作用的抑制效果。

圖2 單分子層合成與酶活性表征的方法[18]

除了分析蛋白激酶，Kuo等[19]還將該方法運用于其他酶活性檢測。通過分析CHRF巨核細胞(Mk)細胞裂解液中賴氨酸脫乙酰酶(KDAC)的活性，驗證了該方法的可行性。利用類特異性去乙酰化酶抑制劑研究表明，分化晚期的巨核細胞表現為6種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴型的去乙酰化酶(SIRTs)活性明顯下降，而另11種二價離子依賴型的去乙酰化酶(KDACs1-11)活性變化不大。該研究建立的平臺可用于識別細胞裂解物中多種酶活性的變化。

除了將肽段作為金-硫單分子層的固定化底物外，Ban等[20]還設計了直接在生物芯片上制備寡聚糖陣列的方法，以快速有效地研究其相關蛋白的生物活性。該方法首先將含有苯酚末端的硫醇烷基鏈組裝到金表面，酚基作為親核試劑與第一個糖結合，再利用糖的末端高效地合成不同的寡聚糖陣列，并檢測了β-1,4-半乳糖基轉移酶的特異性，如圖3所示。此外，Kim等[21]通過將帶有生物素標記的DNA底物固定在自組裝的單層鏈霉親和蛋白層上，制備了寡核苷酸陣列。該陣列在3’端具有正常匹配和錯配堿基對的復合物，還包括該位點的一些刪除和插入。用連接酶和三磷酸腺苷(ATP)或三磷酸類似物核苷處理陣列，再用基質輔助激光解吸電離質譜分析，比較了5′-探針鏈的腺化和連接的產物量。由此揭示了連接酶特異性，并發現使用ATP類似物可以提高酶的特異性。該方法可廣泛應用于以核酸為底物的酶活性分析。Choi等[22]報道了一種基于在金上自組裝單分子層的氯霉素(CAP)乙酰轉移酶(CAT)活性的測定方法。在乙酰輔酶A存在下，CAT將單分子層上的CAP轉化為乙酰化的CAP。利用MALDI質譜技術，通過觀察CAP分子質量的變化，直接監測其轉化過程。

圖3 在芯片上合成低聚糖的方法[20]

以上方法的特點在于將酶底物固定在惰性表面上，通過清洗去除干擾分子，很大程度上簡化了樣品前處理過程。這種策略基于MALDI-TOF MS的特點提供了一種簡單、快速、高通量、免標記的檢測方法。然而，此方法通過共價鍵(Au-S)固定底物,用MALDI-TOF MS檢測時需經過Au-S鍵斷裂過程。因此可能會導致底物和產物測定不完全,影響定量效果。Hu等[23]提出了一種肽編碼的酶活性分析微板。將蛋白酶特異性的底物肽段直接固定在微板上，與目標蛋白酶作用后，從微板中釋放出編碼區域，以單氨基酸差異的相應肽段為內標直接定量分析。編碼區域可作為唯一的“蛋白酶ID”用于識別相應的蛋白酶，裂解產物的量用于蛋白酶活性分析。以胰酶和糜蛋白酶為模型蛋白酶進行了多重蛋白酶試驗，結果顯示肽編碼微板具有良好的選擇性。該方法為多種蛋白酶的鑒定和活性定量分析提供了有力的工具，但主要針對蛋白水解酶，不適用于蛋白激酶等其他酶。

1.2 通過非共價作用固定底物

除了在金-硫單分子層上利用含特殊官能團的硫醇烷基鏈來固定特殊肽段或寡聚糖來制備陣列，酶底物的固定化過程還可通過非共價作用完成。Sanchez-Ruiz等[24]將疏水自組裝單層膜置于金板上作為支架，然后將一系列用脂質修飾的不同寡糖通過疏水-疏水相互作用固定在疏水單分子層板上，形成寡聚糖陣列(如圖4)。基于酶作用后產物的不同，此陣列使區分不同的糖基水解酶活性成為可能，提高了聚糖陣列的結構多樣性。隨后，Beloqui等[25]利用該方法快速檢測了環境樣品中糖基水解酶活性和特異性。與其他方法相比，基于膠體的系統需要優化。此方法疏水表面和糖的標記更易制備，而且平面非多孔表面使酶易于接近反應表面和提高穩定性。該方法適于環境樣品和復雜體液的功能分析。此外，該課題組[26]還對單分子層的材料進行了改良，選擇商用的ITO涂層玻片，用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)對其硅烷化，然后與硬脂酸偶聯，為固定脂質標記的生物分子創造了疏水支撐層。這種單分子層基底可獲得更高的表面覆蓋度和疏水性。聚糖與疏水層結合能形成良好的斑點形態，為酶活性分析提供了良好的基礎。然而MALDI-TOF MS檢測技術對待測物的質譜響應性要求高，因此質譜響應信號直接影響定性、定量檢測的準確性。Hu等[27]用兩親性的磷脂標記蛋白酶底物多肽，通過疏水相互作用固定在硬脂酸改性的ITO載玻片上，組裝成不同半胱天冬酶的肽底物陣列，通過對酶裂解前后的肽段進行鑒定能夠直接分析多種酶活性。由于磷脂在負離子模式下的離子化效率高，可得到很好的質譜響應信號。因此，該方法用于質譜成像獲得了良好的可視化結果，具有多重酶活性分析和可視化特點，為酶的活性分析、耐藥性鑒定和抗癌藥物療效評價提供了有力手段。

圖4 利用疏水相互作用固定底物和酶活性表征的過程[24]

圖5 DUB活性表征過程[28]

2 基于均相酶催化反應

2.1 免標記法

相比于非均相酶催化反應，均相酶催化反應更有利于底物和酶的接觸性。Ritorto等[28]用MALDI-TOF MS技術在體外分析了42個人泛素分解酶(DUB)對所有泛素拓撲異構體(M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48和 K63-linked chains)的活性以及特異性，并篩選了DUB抑制劑。此方法以同位素標記的N15-泛素為內標，對底物裂解的泛素單體進行定量，得到了良好的線性關系(如圖5)。為減少干擾，在用MALDI-TOF MS檢測之前對酶進行了去除。該方法免標記、快速，適合于大量篩查酶活性。

2.2 反應后產物標記法

檢測復雜樣品如血液、細胞或組織中酶活性時，酶底物或產物的信號會被其他物質所干擾，因此開發對特定底物或產物進行分離富集以及選擇性定量分析，并能夠對多種酶進行同時分析的方法，對于酶活性評價和酶抑制劑篩選起著重要作用。Yang等[29]合成一種末端含有酰肼的氟化物探針，此探針與α-葡萄糖苷酶水解后的糖反應，并通過與氟化金單分子層表面的氟相互作用而被固定，然后用MALDI-TOF MS進行檢測并測定酶活性。采用此方法測定了兩種酶抑制劑的IC50值，證明該方法適用于酶抑制劑的篩選。然而在蛋白激酶催化過程中，由于反應混合物中含有豐富的非磷酸化肽，會對磷酸化肽的信號產生，因此Lv等[30]在酶催化反應之后，利用自制的二氧化鈦納米顆粒填充的毛細管柱，從復雜混合物中分離富集磷酸化肽，提高其信號強度。通過合成與底物肽分子量相似的肽段作為內標，定量分析了磷酸化效率。通過測定臨床治療慢性骨髓白血病的一種藥物(Abl的抑制劑)的IC50值，驗證了MS方法的有效性。然后利用該方法篩選了實驗室合成的6個該藥物類似物，得到的結果與酶聯法吻合。Deng等[31]開發了用于MALDI-TOF MS定量分析多種蛋白激酶活性的同位素二甲基標記底物的方法。采用穩定同位素二甲基標記法，在一個MALDI靶點上實現了在單個和多重底物體系中，對不同反應時間下蛋白激酶A(PKA)活性的監測。此外，通過完整的標記和精確的定量，可以準確得到動力學常數。該方法還成功地應用于激酶抑制劑的篩選。因此，該方法能夠高通量、簡單、快速、經濟有效和準確地定量激酶和激酶抑制劑。Gregorius等[32]還提出了將金屬標記肽用于多重酶活性測定。蛋白水解反應后，利用絡合稀土金屬離子使胰蛋白酶酶解反應后生成的剩余底物和肽產物形成金屬螯合物進行標記。使用MALDI質譜對簡單肽混合物進行定量，或使用LC-MALDI質譜對復雜底物混合物的標記肽進行定量，其準確度高，動態范圍寬(至少2個數量級)，可用于監測隨時間變化的產物形成和底物消耗過程。由于該方法具有多路復用能力和準確性，在生物化學和生物技術領域具有廣泛的應用前景。

2.3 反應前底物標記法

除了對酶與底物反應后的產物、剩余底物進行標記富集外，Ling等[33]報道了一種芘連接的底物肽，用于MALDI-TOF MS定量測定蛋白酶活性。該方法選擇了一個序列為GGGGRG的胰蛋白酶特異性肽段與芘結合，形成了芘連接肽探針Py-GGGGRG。在胰蛋白酶存在下，Py-GGGGRG探針可以特異性水解成Py-GGGGR。芘的引入大大提高了肽段的電離效率，由于底物和產物的分子量相似，可以直接通過底物和產物的強度比例進行定量。并且利用芘的疏水性和共軛結構，用聚苯乙烯涂層的MALDI板可選擇性地從復雜混合物中捕獲芘肽段。該方法的線性范圍寬，檢出限低，已成功地用于尿液中胰蛋白酶活性的定量測定和胰蛋白酶抑制劑的篩選。此外，還利用探針Py-GGGGGGYG對糜蛋白酶進行了驗證。該方法簡單、高通量、定量準確，在多種蛋白酶活性測定和特定肽序列篩選抑制劑方面具有很大的應用潛力。眾所周知，MALDI-TOF MS技術由于基質小分子干擾，在小分子區域酶底物或產物的測定方面受到限制。Wang等[34]報道了一種蒽醌-谷胱甘肽(Aq-ECG)探針，利用MALDI-TOF MS快速定量分析谷氨酰基轉肽酶(GGT)的活性(如圖6)。該探針是一種水溶性分子，由芳香蒽醌(Ag)和谷胱甘肽(ECG)通過一步硫醇-烯反應共價連接。蒽醌部分的作用不僅是在GGT催化裂解后提高目標離子的分子量，使目標離子出現在較高的m/z區域，避免基質離子的干擾，而且能顯著提高肽的電離效率。此外，磁性氧化石墨烯可以選擇性捕獲蒽醌部分，將目標物與復雜混合物分離。使用一個蒽醌連接的甲基化谷胱甘肽作內標，可以定量分析GGT活性。利用該探針在健康人和肝癌病人血清樣本中能檢測到GGT，結果與酶聯免疫吸附法測定結果一致。該方法還成功地應用于不同腫瘤、正常細胞內源性GGT含量的檢測以及抗癌藥物丁酸鈉對GGT活性抑制作用的研究。利用該分子探針，開發了一種簡單、靈敏、經濟的方法，可以準確定量地測定GGT活性并篩選其抑制劑或抗癌藥物。該方法也可改變探針部分，廣泛應用于其他蛋白酶活性分析。

圖6 Aq-ECG和Aq-ECA的合成路線(A)以及基于Aq-ECG的酶活性分析方法流程圖(B)[34]

表1中對上述主要的方法進行歸納總結，列舉了不同方法的基本原理、適用范圍和優缺點。

表1 酶活性分析方法性能的比較

3 結論與展望

綜上所述，由于MALDI質譜的高通量、高耐鹽性等優點使得其在酶活性分析和酶抑制劑篩選中具有獨特的優勢。與其他傳統分析方法相比，MALDI質譜能夠直接檢測酶催化反應的底物和產物的分子量信息，并且特別適用于多種酶的同時分析，在定性和定量分析方面均有廣泛的應用前景。然而MALDI-TOF MS的重現性較差，用小分子有機基質時，由于結晶不均勻，會導致響應差異。基于MALDI-TOF MS的酶活性分析還需要提高底物或產物的離子化效率以及重現性，以提高酶活性分析的靈敏度以及定量準確性。因此，開發更簡單、快速、效率高的酶活性分析MALDI-TOF MS平臺在臨床檢測中具有重要意義。