羰基化蛋白質組學分析進展

周家華，秦洪強，葉明亮*

(1.中國科學院大連化學物理研究所 國家色譜研發中心，中國科學院分析化學分離科學重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.中國科學院大學，北京 100049)

1 氧化應激與蛋白質羰基化

絕大多數真核生物的生命活動都離不開氧氣，氧氣與高等生物體的能量代謝等過程密切相關[1-2]。氧氣分子在代謝中間體、酶和輻射作用下產生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，其在正常生理條件下對細胞代謝的調控發揮著至關重要的作用[3]。然而，當產生的ROS超過生命體內源性抗氧化防御的緩沖能力，即氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡被打破時，將導致氧化還原信號與控制機制的破壞和/或分子損傷[4]，產生氧化應激效應(Oxidative stress,OS)，進而導致脂質、DNA/RNA和蛋白質等重要生命體活動承擔者的功能受損。當持續氧化應激產生時，將對蛋白質、DNA和RNA等生物分子造成不可逆損傷，并造成蛋白酶體和溶酶體降解氧化損傷蛋白質的能力降低，使細胞活力降低，甚至造成細胞死亡[5-6]。氧化應激異常與衰老過程以及多種疾病的發生密切相關，包括動脈粥樣硬化、惡性腫瘤、阿爾茨海默病和帕金森病等神經退行性疾病[7]。

蛋白質羰基化(Protein carbonylation,PCO)是指蛋白質在氧化應激狀態下產生醛、酮或內酰胺等活性羰基官能團[8]。PCO是危害性最大的蛋白質翻譯后修飾之一，可造成蛋白質結構的不穩定和功能的不可逆損傷[9]。有關蛋白質羰基化的研究始于20世紀80年代初，由美國國立衛生研究院(National Institutes of Health,NIH)的Stadtman實驗室開創[10]。蛋白質羰基化被視為氧化應激的生物標志物，在細胞、組織和器官衰老中的作用受到特別關注[11]。Levine和Stadtman提出蛋白質羰基化水平隨著年齡的增長而增加，以此支持細胞或生物體水平上衰老的自由基(氧化應激)理論[12-15]，故蛋白質羰基化是與衰老相關的重要候選生物標志物。同時，蛋白質羰基化會調控蛋白功能，進而影響相關信號轉導網絡，造成疾病相關蛋白質功能的不可逆損傷[16]。因此，羰基化對于蛋白質功能的發揮具有至關重要的調節作用，實現蛋白質羰基化的表征，可以提供氧化應激相關蛋白的作用網絡，為相關疾病的分子機制研究提供重要信息[17]。

2 蛋白質羰基化途徑

蛋白質羰基化存在超過35種形式[18]，按照其產生方式主要分為以下4類[10](圖1)。

圖1 蛋白質羰基化的主要途徑

2.1 蛋白質、多肽主鏈骨架的裂解

蛋白質的多肽骨架中氨基酸的α-碳原子可被ROS攻擊，形成烷氧基自由基，隨后以α-酰胺化或二酰胺途徑裂解。前者的鍵斷裂發生在自由基起始位點的N-末端一側，使來自蛋白質N-末端部分的多肽片段帶有C-末端酰胺，而來自蛋白質C-末端部分的多肽N-末端具有N-α-酮酰基；后者的骨架裂解由α-碳起始位點的C-末端側的鍵斷裂引起，使來自蛋白質N-末端部分的新多肽的C-末端形成二酰胺，而來自蛋白質的C-末端部分的多肽N-末端產生異氰酸酯基團。

2.2 蛋白質氨基酸側鏈的氧化

ROS可通過直接攻擊蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸的側鏈，引入活性羰基。以賴氨酸為例，羥基自由基在賴氨酸側鏈的C6位置奪取氫，形成以碳為中心的自由基。過渡金屬離子接受碳自由基的孤電子對后，產生賴氨酸亞胺，隨后通過釋放銨離子自發水解成氨基己二酸半醛(AAS)。類似地，精氨酸氧化成谷氨酸半醛(GGS)，蘇氨酸氧化成2-氨基-3-酮丁酸，脯氨酸氧化得到GGS和2-吡咯烷酮。

2.3 脂質過氧化產物對蛋白活性位點的加成

ROS對脂質的進攻引起脂質過氧化(Lipid peroxidation)，產生α,β-不飽和醛、二醛和酮醛等被稱為活性羰基物質(Reactive carbonyl spices,RCS)的代謝產物(又稱Lipid-derived electrophiles,LDEs，即脂質衍生親電試劑)，如丙烯醛(Acrolein,ACR)、丙二醛(MDA)、4-羥基-2-壬烯醛(4-Hydroxy-2-nonenal,HNE)等。這些活性羰基物質可以通過邁克爾加成或生成席夫堿的形式加合到親核氨基酸(即半胱氨酸、組氨酸和賴氨酸)上引入活性羰基。研究這類共價修飾作用不僅能夠發現親電性化學信號的調控機制，而且對目前藥物化學領域熱門的靶向共價抑制劑開發有著重要參考價值。

2.4 糖化的氧化產物

氨基酸和還原糖之間發生被稱為美拉德反應的非酶促反應，在一系列化學重排之后，可以在蛋白質側鏈引入活性羰基。除此之外，糖酵解中間體降解產生的小分子醛類，如乙二醛(MG)、甲基乙二醛(MGO)和3-脫氧葡糖醛酮(3-DG)也可以加合在蛋白質上從而引入活性羰基。

3 蛋白質羰基化的富集檢測方法

目前，蛋白質羰基化的鑒定和定量技術主要分為以下3類：(1)分光光度法和色譜法測定總蛋白質羰基含量;(2)生物化學和免疫學技術，如免疫印跡和ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay ，酶聯免疫吸附測定法)，提供有關修飾蛋白和羰基化水平的全局性信息;(3)基于質譜(MS)的羰基化檢測技術，用于鑒定蛋白質的修飾位點以及蛋白質結合的羰基化合物的相對定量[19]。質譜以外的其他方法雖然能夠高靈敏度檢測氧化修飾蛋白質，卻不能提供修飾蛋白質特性以及修飾本身的化學性質和位點等信息。基于質譜的蛋白質組學的進步，使蛋白質羰基化的規模化研究成為可能，進而為蛋白質羰基化的相關調控通路研究提供了數據支撐[19]。目前采用的蛋白質組學方法主要分為凝膠電泳與非凝膠電泳兩大體系(圖2)。

圖2 蛋白質羰基化蛋白組學分析方法

3.1 凝膠電泳體系

二維(2D)凝膠電泳已被廣泛用于復雜樣品中羰基化蛋白質的鑒定。由于相對豐度低、化學穩定性差、缺乏特定的物理化學性質(如吸收或熒光)，羰基化蛋白質通常無法直接檢測，其檢測和定量需要使用特定的化學探針進行衍生化[15]。

2,4-二硝基苯肼(2,4-Dintrophenylhydrazide,DNPH)可與活性羰基反應，形成穩定的2,4-二硝基苯腙，其吸收光譜在365～375 nm處具有特征吸收峰。Levine等[20]首先使用DNPH，通過DNP(2,4-二硝基苯基)基團在360 nm處的吸光度來測定羰基化程度。這一思路被發展為“oxyblot”技術應用于蛋白質印跡法，即先用DNP衍生羰基化樣品，再使用抗DNP抗體進行檢測[21-22]，還可以通過質譜法進行凝膠內消化后對羰基化修飾位點進行鑒定。

酰肼基團可以與活性羰基反應形成腙加合物，其含有的不穩定亞胺鍵，可被氰基硼氫化物特異性還原。此外，酰肼還可以引入多種官能團(如生物素、洋地黃毒苷和與酰肼偶聯的各種熒光化合物等)后再與羰基反應，如可以用洋地黃毒苷-酰肼衍生化羰基并以抗洋地黃毒苷抗體進行檢測，或用生物素-酰肼衍生化并用熒光素標記的親和素檢測。熒光素縮氨基硫脲和熒光素酰肼首先由Stadtman等[23]用于在一維凝膠中檢測羰基；Regnier等[24]采用生物素化和親和素-異硫氰酸熒光素(Biotinylation and avidin-fluorescein isothiocyanate,FITC)親和染色法，建立了二維電泳中羰基化蛋白的檢測方法，在用過氧化氫刺激后的酵母蛋白質組中鑒定出20種羰基化蛋白質。2D凝膠電泳可以在各種生物條件下用于差分氧化蛋白質的鑒定，但其靈敏度較低，不易檢測低豐度的蛋白質，操作費力且不允許高通量檢測[25]。

3.2 非凝膠電泳體系

質譜法是蛋白質組學中用于鑒定蛋白質，尤其是PTM(Post-translational modification，翻譯后修飾)表征的最通用技術。使用質譜法的無凝膠方法已經成為研究蛋白質羰基化的最有力技術。蛋白質羰基化的各項研究受制于其低豐度、低電離效率、可能產物的異質性以及與分析期間存在的其他化合物的反應性。因此在質譜分析之前，分離羰基化肽和蛋白質的富集策略通常是必需的[26]。

3.2.1 基于競爭性反應策略對半胱氨酸羰基化修飾的間接鑒定脂質過氧化產物會特異性修飾蛋白質的半胱氨酸等活性位點，進而影響蛋白質的功能。可以通過硫醇反應性化學探針標記未被修飾的半胱氨酸活性位點，結合蛋白質定量組學方法，間接實現相關羰基化蛋白質底物及作用位點的鑒定。Cravatt等[27]基于競爭性isoTOP-ABPP(Isotopic tandem orthogonal proteolysis-activity-based protein profiling,同位素串聯正交蛋白水解-基于活性的蛋白譜分析)策略，使用LDE(引入活性羰基基團)或DMSO(Dimethylsulfoxide,二甲基亞砜)處理蛋白質組，再用硫醇反應性碘乙酰胺(Iodoacetamide,IAM)-炔探針標記，通過CuI催化的疊氮化物-炔烴環加成反應(點擊化學)綴合上可切割的、同位素標記的生物素標簽，以鏈霉親和素珠富集，珠上酶解得到探針標記肽段，并用LC-MS/MS鑒定和定量。該策略能夠通過半胱氨酸反應性碘乙酰胺-炔(IA)探針定量蛋白質組中LDE修飾的1000多個半胱氨酸位點。由于對半胱氨酸的LDE修飾可以競爭性地阻斷其IA-炔烴標記，DMSO處理的(輕)與LDE處理的(重)信號之間的定量比率準確地反映了對半胱氨酸LDE修飾的程度。該方法基于LDE和碘代乙酰胺探針對半胱氨酸活性位點的競爭作用，有效實現了LDE相關底物的篩選，并獲取了相應的底物位點信息。然而，該方法只能間接獲取LDE對蛋白質中半胱氨酸殘基的修飾位點信息，無法獲取LDE與組氨酸和賴氨酸修飾位點信息。

3.2.2 通過生物正交LDE-類似物探針對特定羰基化類型進行檢測鑒定與基于競爭作用的間接羰基化檢測方法相比，實現修飾位點的直接鑒定具有更高的靈敏度，并能有效減少假陽性干擾。Marnett等[28]設計合成了帶有疊氮或炔基的4-羥基-2-壬烯醛(HNE)類似物，并將其加入到RKO細胞(Human colon adenocarcinomacells,人結腸腺癌細胞)中，使RKO細胞中靶蛋白產生羰基化修飾，再加入相對應的接入炔基或疊氮基團的生物素，利用點擊化學反應獲得生物素化靶蛋白，最后用鏈霉親和素珠親和純化。針對鏈霉親和素結合非特異性蛋白質以及生物素標簽影響質譜檢測等問題，Porter等[29]提出了親和純化-光致分離策略，開發了一種可由光裂解的疊氮-生物素標簽，可以實現鏈霉親和素捕集的HNE-炔烴探針加合蛋白質或肽段的特異性釋放，并用脂質衍生親電試劑HNE和4-氧代-2-壬烯醛(4-oxo-2-Nonenal,ONE)的炔基類似物進行了一系列定量加合物分析實驗[30]。在此基礎上，Liebler等[31]開發了一種以位點為中心的定量化學蛋白質組學方法，其核心在于在光可切割疊氮基生物素試劑中接入輕重同位素標記，有效提高了鑒定位點的可信度，實現了對約400個HNE修飾位點的大規模、原位、位點特異性鑒定和定量。

生物正交法局限于只能鑒定特定類型的羰基化修飾，不能捕獲蛋白質組中所有類型的羰基化修飾蛋白。合成特定LDE類似物探針成本較高、工作量大，此外，在LDE上接入炔基或疊氮化物可能會改變它們的物理和化學性質，反過來又會影響其與一些天然靶蛋白的相互作用。

3.2.3 靶向活性羰基的化學捕集策略

(1)“一體化”生物素探針

利用某些化學基團可以快速動力學和高特異性結合活性羰基形成穩定的共價加合物的性質，將其與生物素連接為探針，再使用親和素進行捕獲，可以實現衍生化羰基化蛋白/肽段的高效富集。其中使用最廣泛的是生物素酰肼(Biotin hydrazide,BHZ)探針[32]。

Yang等[33]將BHZ與樣品中羰基化蛋白反應生成亞胺，并用氰基硼氫化鈉特異性還原亞胺穩定產物，用鏈霉親和素珠捕集生物素化蛋白，珠上洗滌、還原、烷基化封閉、酶解后，取酶解上清液進行LC-MS/MS檢測。該研究在單次LC-MS/MS實驗中能夠鑒定老年小鼠中的至少100種羰基化蛋白質。

親和素可在廣泛的pH值范圍內以非常高的親和力結合生物素化多肽，使攜帶位點信息的肽段難以從珠上釋放，因而無法得到所對應蛋白質中羰基化修飾的具體位點。無論是為了更深入地理解氧化應激導致活組織損傷和功能喪失的原因和機制，還是為了提高鑒定結果置信度，鑒定蛋白質序列中的氧化位點都是必要的。鑒于此，Regnier等[34]采用親和能力較弱的固定化單體親和素構建層析柱，柱上捕獲的生物素化蛋白質使用2 mmol/L生物素或0.1 mol/L甘氨酸[18]洗脫下來，從而獲得含有羰基化位點的肽段。Regnier等[35]在親和富集后通過反相液相色譜(Reversed-phase liquid chromatography,RPLC)在C8柱上進一步分離分析羰基化蛋白質，并首次報道了基于蛋白質組學的人血漿中氧化蛋白的鑒定和表征[36]。

內源生物素化蛋白質，以及通過疏水和(或)靜電相互作用與親和素非特異性結合的蛋白質和肽段，是生物素探針法鑒定羰基化蛋白的主要干擾源[19]。為了有效鑒定特異性純化的蛋白質組分并過濾掉非特異性背景蛋白質，Griffin等[37]對親和純化后的蛋白進行穩定同位素標記。該方法結合了蛋白質羰基的生物素酰肼標記、親和素親和層析、多重iTRAQ(Isobaric tag for relative absolute quantitation,同位素標記相對和絕對定量)試劑穩定同位素標記等方法，并嘗試在線性離子阱質譜儀上使用脈沖碰撞解離(PQD)操作，定量富集得到200多種羰基化蛋白。與之類似的同位素標記方法已被廣泛應用于人體血漿[38]、鼠血漿[39]、RCS修飾蛋白質[40-42]中羰基化的鑒定。

由于羥胺與活性羰基生成產物的肟鍵(Keq>108M-1)比與酰肼反應生成產物的腙鍵(Keq約為104～106M-1)穩定得多[43]，ARP(Aldehyde-reactive probe，醛反應性探針)作為最開始被用于DNA修飾檢測的生物素化羥胺衍生物，因不需要額外的還原步驟，而成為廣泛應用的一種酰肼生物素替代品[44-47]。

基于酰肼或羥胺生物素化探針的富集方法，能夠實現多種內源性羰基化蛋白質的高效捕獲，并通過蛋白質組學技術實現多種類型內源性羰基化的直接鑒定。然而，由于缺乏有效的脫除手段，龐大的生物素基團限制了MS分析過程中羰基化肽序列的碎裂和鑒定效率，并且冗長的生物素側鏈的片段化使質譜解析變得更加復雜。針對以上“一體式”探針面臨修飾位點鑒定效率低的問題，實現羰基化修飾肽段可控釋放成為研究的熱點。

(2)“分體式”可控釋放探針

Griffin等[48]提出一種基于固相酰肼(SPH)試劑開發的無標記策略，通過形成共價可逆的腙鍵，可在酰肼包被的玻璃珠上捕獲HNE修飾肽，并在較高溫度(60 ℃)和低pH值(10%三氟乙酸或甲酸)下洗脫釋放。類似地，基于Affi-gel酰肼珠的共價色譜法在自下而上的蛋白質組學方法中得到很好的應用，譬如該酰肼珠富集法也被應用于糖基化修飾的研究[49]。Maier等[42]將用于相對定量的d0/d4-琥珀酸酐-肽胺標記方法和用于捕獲脂質過氧化產物-肽綴合物的Affi-gel酰肼珠富集方法結合，實現了羰基化蛋白/肽段的富集和定量分析。Prokai等[40]通過還原烷基化對HNE-修飾的肽進行二甲基標記，使用固相酰肼化學捕集羰基化肽段，再由酸催化釋放回收。這種以修飾為重點的定量有助于表征蛋白質功能的伴隨變化，并且可提供有關分子信號傳導機制的重要信息，加深對與氧化應激相關的細胞過程的理解，但是該方法酸釋放的條件比較苛刻，且仍然面臨釋放不完全的問題。

GPR(Girard preagent:1-(2-hydrazino-2-oxoethyl) pyridinium chloride,1-(2-肼基-2-氧代乙基)吡啶鎓氯化物)是最初開發用于衍生和溶解類固醇的系列試劑的一部分[50]，其酰肼基團易與羰基反應，而季銨基團則可向氧化蛋白質和肽添加正電荷。Regnier等[51]將GRP與羰基化蛋白質反應，還原、酶解后用SCX(Strong cation exchange，強陽離子交換)色譜法富集。接著，兩種同位素形式的GPR試劑被用于量化和表征酵母提取物中蛋白質羰基化位點[52]。與此有異曲同工之妙的是，Lu等[53]開發了基于氟衍生化和FSPE(Fluorous solidphase extraction,氟固相萃取)的新方法，將標記的肽與固相氟特異性結合用于HNE修飾肽富集。該方法的優點是氟標簽可以在MS分析期間增強HNE修飾肽的強度，從而有助于鑒定HNE-修飾的肽，并促進氟衍生化肽段的MS/MS片段化。

AminoxyTMT(Aminoxy tandem mass tag,羥胺串聯質量標簽)是串聯質量標簽(Tandem mass tag,TMT)同量異位標記試劑的衍生物，Griffin等[54]利用其羥胺基官能團共價標記蛋白質中的活性羰基并實現了富集。Lu等[55]提出了六重同量異位標記親和純化(SiLAP)策略，使用aminoxyTMT標記試劑和抗TMT抗體樹脂同時實現HNE修飾蛋白的選擇性富集和特異性位點的準確定量，量化了2 257種獨特的HNE修飾肽和1 121種HNE修飾蛋白。

Wang等[56]合成了生物正交的含炔基酰肼探針(HZyne)和羥胺衍生探針(Ayyne)，評估了它們捕獲HNE修飾的蛋白質和殘留位點以進行MS鑒定的能力，通過基于二甲基標記的RD-ABPP(Reductive dimethylation-ABPP,還原型二甲基標記-ABPP)策略，定量了4 000多個HNE修飾蛋白細胞裂解物；通過TOP-ABPP(Tandem orthogonal proteolysis-ABPP,串聯正交蛋白水解-ABPP)策略鑒定了約400個高可信度的HNE加合位點。Yang等[57]使用前述HZyne探針，富集并分析了肽骨架碎裂形成的全局和位點特異性的親電子蛋白質降解物，并鑒定到N-甲酰基多肽這一新的羰基化產物。值得注意的是，Yang提及了將定量化學蛋白質組學與開放式搜索工具相結合的潛在應用前景。Wang等[58]開發了一種苯胺衍生的探針，并結合ABPP策略分析鐵死亡(ferroptosis)中的羰基化蛋白，鑒定到400多種內源性羰基化修飾蛋白質和20余個殘基位點。Wang等[59]將苯胺探針用于鑒定丙烯醛(ACR)修飾位點，鑒定了2 300余種蛋白質和500余個由丙烯醛靶向的半胱氨酸位點。

這些基于可控釋放思路開發的新型探針，極大地提高了羰基化蛋白及其位點的鑒定數量和質量，推動了蛋白質羰基化的研究進程，但此類方法操作步驟較為繁瑣，肽段攜帶標簽依然較大，因此尚需開發新的更好的方法解決此類問題。近來,Aye等在T-REX[60](Targetable reactive electrophiles and oxidants,靶向活性親電物質和活性氧)基礎上開發出G-REX[61]技術，即在細胞內異位表達HaloTag蛋白，該蛋白可特異性結合光籠裝RES(Reactive electrophilic specie,活性親電物質，即上文所述RCS)前體。在低能量光照射下，體內可控釋放RES，如5 min內細胞最多可釋放出5 μmol/L HNE-炔烴，大大減輕了此前研究體外大劑量暴露相關的毒性/脫靶效應，進而提高了所鑒定到羰基化位點的可靠性。可以預見G-REX在研究氧化應激，特別是RES相關的蛋白質羰基化方面的巨大潛力。目前G-REX誘導得到的HNE修飾蛋白依然使用鏈霉親和素點擊/生物素親和富集的方法。如前文所述，這無疑限制了該技術的更有效應用。我們認為應該利用新的化學反應，開發新型可逆生物正交探針，其應滿足：①高效特異地與羰基化蛋白結合，最好與活性羰基結合；②能夠被有效地富集出來；③與羰基化蛋白的結合應該是可逆的，以方便地釋放富集蛋白/肽段，獲取羰基化位點信息；④如果可能，該探針應該與G-REX技術兼容。G-ERX技術與新型探針富集技術的配套使用，必將有力推動蛋白質羰基化研究的進程。

4 結 語

化學生物學技術的快速發展為蛋白質羰基化的富集提供了更多的有力工具，而質譜技術的發展則為蛋白質羰基化提供了檢測手段，兩者的結合極大地推動了蛋白質羰基化的研究進展。然而，蛋白質羰基化具有高度動態性，并且存在數目繁多的修飾形式，實現不同類型羰基化的同時檢測尚需要富集、檢測技術的進一步完善，并且需要借助相關生物信息學技術的發展。隨著相關技術的進一步發展，蛋白質羰基化的研究必將大為加速，進而為闡明氧化應激的機制提供技術支撐。