多囊卵巢綜合征相關雄性激素的液相色譜-串聯質譜檢測

曹 正，劉 穎，叢宇婷，盧一凡，董 瑩，劉京瑞，唐國棟,3，翟燕紅*

(1.首都醫科大學 附屬北京婦產醫院 檢驗科,北京 100020；2.上海愛博才思分析儀器貿易有限公司,上海 200050；3.北京市海淀區婦幼保健院 產前診斷中心,北京 100080)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種常見的婦科內分泌疾病，起病多見于青春期，臨床上多以月經不調為主要癥狀，可有不孕[1]、多毛痤瘡、肥胖、黑棘皮癥等多種不同臨床表現[2]。一直以來，PCOS病因未明且缺乏統一的診斷標準[3]，給臨床工作造成諸多不便。美國生殖醫學學會與歐洲人類生殖和胚胎學會于2003年修訂PCOS診斷標準[4]：① 稀發排卵或無排卵；② 高雄性激素的臨床或生化表現；③ 經超聲提示單側或雙側卵巢多囊性改變。凡符合上述三條標準中的兩條，并排除其他疾病導致的類似臨床表現即可診斷為PCOS。

高雄性激素血癥被普遍認為是PCOS關鍵的病理生理改變[5]，對雄性激素的檢測是臨床診斷PCOS的重要指標[6]。在女性體內存在多種雄性激素，其中，睪酮(T)的血清水平高于其他雄性激素，是PCOS中主要的病源性雄性激素[7]。目前，臨床大多依靠檢測睪酮血清水平判斷患者是否存在高雄性激素血癥[5]。對睪酮的檢測主要有總睪酮(TT)和游離睪酮(FT)，其中在人體中發揮有效生物活性的是FT[8]。美國近期的最佳實踐總結中認為FT是診斷女性雄性激素過剩最敏感的指標[7-9]。臨床對FT的直接測定具有較多限制且結果的靈敏度和準確性較低。但可通過檢測TT進而計算FT含量[10]。此外，硫酸脫氫表雄酮(DHEAS)、雄烯二酮(A4)、17-羥基孕酮(17-OHP)、雙氫睪酮(DHT)也是人體內重要的雄性激素類型，一些研究表明，這些激素的血清水平在PCOS患者與正常人群中存在差別[7]，可為PCOS的診斷提供參考。50%的PCOS病人會出現血清DHEAS水平的升高，其中5%的患者有且只有DHEAS這一種雄性激素特異性升高”[11]，同時檢測T和DHEAS可以提高PCOS的診斷率。A4是T的直接前體，因此往往在評估高雄性激素血癥時會檢測A4，據報道，雄性激素檢測中如果加入A4，大約可以提高9%的PCOS檢出率[9]；DHT是睪酮經過5α-Reductase作用轉化而來，其雄性激素活力最強，因此在睪酮水平正常的PCOS病人中，檢測DHT能夠幫助解釋局部目標組織中雄性激素活性過高的現象[9]；17-OHP是類固醇合成通路中的中間物質，同時也是鹽皮質激素和雄性激素的前體[9]，其血清水平在非典型腎上腺皮質增生(Non-classic CAH)病人中異常升高，因此17-OHP被許多相關專業學會推薦用于PCOS病患診斷，以排除 Non-classic CAH[7,9]。

臨床實驗室多采用自動化免疫法檢測雄性激素，但其特異性差，易受溫度、pH值、離子強度、試劑免疫活性、異噬性抗體等因素干擾而造成假陽性或假陰性結果，特異性和準確性有待提高[12-13]。近年來液相色譜-串聯質譜技術(LC-MS/MS)開始應用于雄性激素的檢測，其因所需樣本量少，可同時檢測多種物質，且精密度和準確性高，被認為是雄性激素檢測的“金標準”[14]。有指南建議，在PCOS診斷中，將LC-MS/MS應用于臨床高雄性激素血癥的檢測，此前有將T和DHT、T和A4進行聯合檢測的報道，其研究結果表明聯合檢測能達到較好的特異性和精確性[15-16]，但目前對上述5種雄性激素進行聯合檢測的報道較少。本研究建立了液相色譜-串聯質譜法聯合檢測DHEAS、A4、T、17-OHP、DHT 5種雄性激素的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AB SECIX TRIPLE QUADTM5500 三重四級桿串聯質譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)以及Analyst 1.4.1數據處理軟件(美國 Applied Biosystem 公司)；島津高效液相色譜系統(日本)。96孔蛋白沉淀板(Agela Cleanert Protein Precipitation Plate，CAT#96CD2025-Q),96孔PEP板(Agela Cleanert PEP 96 Well Microplates，CAT#PE00501-MW)。

甲醇、乙腈(Optima@LC/MS，4 L，美國Fisher Scientific公司)；標準品：T、A4、DHEAS、DHT、17-OHP均為1.0 mg/mL，1 mL/支；睪酮內標(T-C3)、雄烯二酮內標(A4-C3)、硫酸脫氫表雄酮內標(DHEAS-D5)、雙氫睪酮內標(DHT-C3)、17-羥基孕酮內標(17-OHP-C3)均為100 μg/mL，1 mL/支；上述標準品和內標均購自美國Cerilliant公司。

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：Agela Venusil MP C18(3.0 mm×50 mm，3 μm)，流動相A：蒸餾水(含0.02%甲酸),流動相B：甲醇(含0.1%甲酸)，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序為：0～0.5 min，55% B；0.5～3.5 min，55%～90% B；3.5～4.5 min，90% B；4.5～4.6 min，90%～55% B；4.6～6.0 min，55% B，流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量10 μL。

1.2.2 質譜條件離子源為電噴霧離子源(ESI)，檢測方式為正-負離子多反應監測模式(MRM)。電噴霧電壓(IS)為5 500 V；霧化溫度(TEM)為550 ℃；碰撞氣(CAD)為8 L/min；氣簾氣(CUR)為35 L/min。霧化氣(GS1)為80 L/min；輔助加熱氣(GS2)為70 L/min。5種雄性激素的質譜參數見表1，選取Q1質量數為母離子，Q3質量數為子離子進行定量分析。

表1 5種雄性激素的質譜參數

*DP：declustering potential；CE：collision energy；CXP：collision cell exit potential

1.3 標準溶液的配制

取適量標準品，用甲醇定容后，用甲醇稀釋成不同質量濃度的系列混合標準溶液。稀釋后A4的質量濃度0.10、0.20、0.40、1.20、6.00、12.00 ng/mL，T、DHT和17-OHP為0.05、0.10、0.20、0.60、3.00、6.00 ng/mL，DHEAS為10.00、20.00、40.00、120.00、600.00和1 200.00 g/mL，上述即為標準曲線C1～C6標準溶液，將標準溶液置于-20℃保存，使用前取出在室溫下放置0.5 h，混勻后，即可進樣分析。DHEAS、A4、T、17-OHP和DHT的內標用甲醇乙腈(1∶1)分別稀釋至5.00、2.00、10.00、2.00、20.00 ng/mL。

1.4 樣本前處理

取50 μL血清樣品，加入10 μL內標溶液和150 μL甲醇，振搖2 min，過蛋白沉淀板，加入150 μL水，振搖1 min。200 μL甲醇和200 μL水活化PEP板，加載樣品，分別經200 μL的 20%乙腈、正己烷淋洗后，用50 μL甲醇洗脫，在洗脫液中加入50 μL水渦旋混勻，取10 μL上機檢測。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 前處理方法的優化因雄性激素在體內的含量均較少，因此對樣本的前處理關系到實驗結果的準確性。實驗對比了蛋白沉淀法和固相萃取法，其中前者快速、簡便，但處理的樣品凈化程度低，對于體內含量較少的雄性激素并不是最優方法。本實驗采用蛋白沉淀+固相萃取的方法對樣本進行前處理，將已經進行蛋白沉淀的樣品通過萃取柱，可有效去除樣品基質中的干擾物，濃縮目標分析物，提高檢測靈敏度，減少基質效應，適用于對雄性激素的檢測。

2.1.2 色譜-質譜條件的優化考察了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈混合物分別與水、0.1%甲酸、0.02%甲酸組成的不同流動相對5種雄性激素的分離效果及色譜圖峰形的影響。在對比了不同流動相以及加入甲酸前后的分離結果后，最終選擇甲醇與水為流動相體系，并分別加入0.1%甲酸和0.02%甲酸，以使目標分析物的響應強度得到明顯提高，且所得峰形良好。進一步考察了不同柱溫下(35、40、45 ℃)5種雄性激素的響應強度及分離情況，結果表明在柱溫40 ℃下，可得到較理想的實驗結果。

采用ESI正-負離子電離模式掃描分析，在一級質譜分析確定母離子后，進行二級質譜的子離子分析掃描，對去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)以及碰撞室出口電壓(CXP)進行優化，優化后的質譜條件見表1。此時各雄性激素的檢測信號高，峰形良好。

圖1 5種雄性激素的色譜圖

在優化條件下，5種雄性激素的色譜圖見圖1。從圖中可觀察到各雄性激素的色譜圖清晰，峰形良好，在相關保留時間附近無干擾峰，DHEAS、A4、T、17-OHP和DHT的保留時間分別為2.47、3.15、3.49、3.63、4.08 min，表明各雄性激素可在5 min內完成分離檢測。

2.2 線性關系、定量下限及相對標準偏差

將標準溶液按照正常樣本進行處理后進樣分析，考察各雄性激素的線性關系。以樣品中待測物的質量濃度為橫坐標(X,ng/mL)，待測物和內標物的峰面積比值作為縱坐標(Y)，用加權(1/X2)最小二乘法進行回歸計算，得到回歸方程。結果顯示(見表2)，5種雄性激素在一定質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.995。以信噪比(S/N)=10，相對標準偏差(RSD)小于20%作為各成分的定量下限(LOQ)，計算得到5種雄性激素的LOQ為0.025～5.00 ng/mL，RSD均小于20%，滿足統計學要求。

表2 5種雄性激素的線性范圍、相關系數、定量下限及相對標準偏差

表3 5種雄性激素的批內相對標準偏差、批間相對標準偏差及回收率

2.3 相對標準偏差與加標回收率

以5個患者血清混合作為本底，取40 μL混合人血清與一定量的雄性激素標準溶液混合，制成低、高濃度的質控血清(具體濃度見表3)。在1天內分別對低、高2個濃度水平的質控血清進行10次重復處理，檢測5種雄性激素含量，計算批內相對標準偏差(Intra-RSD)；對低、高2個濃度水平的質控血清測定5次，連續測定5 d(n=25)，檢測5種雄性激素含量，計算批間RSD(Inter-RSD)，觀察精密度，同時計算加標回收率。結果顯示，5種雄性激素的批內RSD為3.7%～8.7%，批間RSD為4.1%～8.2%，加標回收率為96.0%～105%，表明本方法對不同質量濃度標本檢測均具有較好的精密度和準確度。

2.4 樣本的穩定性

取未處理血清樣本，在4 ℃下保存3 d，分別于第0、1、3 d按本方法檢測雄性激素的含量；將第0 d處理后的樣本于15 ℃下放置3天，分別于第0、1、3 d檢測雄性激素含量，將檢測值與第0 d的結果作比較，觀察樣本穩定性。檢測結果顯示(見表4)，按本方法處理后的雄性激素樣本，在4 ℃與15 ℃下的穩定性均在80%～120%范圍內，說明本方法的穩定性良好。

表4 5種雄性激素的穩定性

2.5 臨床樣本的檢測

3組不同臨床血清樣本(PCOS病人-血清型高雄性激素、PCOS病人-臨床型高雄性激素、非PCOS-正常女性)各20例，采用上述方法進行樣本前處理，并對血清中DHEAS、A4、T、17-OHP 、DHT進行聯合檢測，以觀察此方法在臨床中的實際應用價值。結果顯示，對PCOS病人中血清型高雄性激素及臨床型高雄性激素患者的檢出率均大于90%，與單純檢測一種雄性激素相比，檢測的精確度與準確性大大提升，在一定程度上解決了女性體內雄性激素水平低、檢測難的問題(見表5)。研究結果表明，利用本方法進行上述5種雄性激素的聯合檢測，對臨床診斷高雄性激素血癥及PCOS病人具有較高的應用價值。

(續表5)

GroupDHEASA4T17-OHPDHT1474.170.460.660.240.231692.610.801.150.420.38?1613.250.900.601.240.72?1357.511.241.014.27?0.37?1622.810.820.692.98?0.94?1326.180.930.953.45?0.16702.870.960.532.07?0.211758.830.912.041.970.262966.60?1.061.100.450.251461.491.060.541.940.081132.420.590.834.31?0.11876.940.980.802.73?0.171151.221.150.793.04?0.23

reference interval:DHEAS:280.00～2 500.00 ng/mL,A4:0.30～2.00 ng/mL,T:0.08～6.00 ng/mL,17-OHP:<2.00 ng/mL,DHT:<0.3 ng/mL

3 結 論

本研究建立了LC-MS/MS聯合檢測血清中DHEAS、A4、T、17-OHP、DHT的分析方法，討論了LC-MS/MS法在臨床中高雄性激素血癥診斷中的應用價值，從而為PCOS的診療提供依據。實驗結果表明，本方法快速簡便，具有較高的精確性和準確性，可保證在血清濃度較低的條件下獲得較為理想的檢測結果，滿足臨床大量檢測的需求，對臨床高雄性激素血癥和PCOS的診斷具有重要意義。