單細胞測序技術及其在乳腺癌中的應用進展

杜彥宏，季雄娟

（無錫市錫山人民醫院檢驗科，江蘇 無錫 214105）

1 單細胞測序技術概況

SCS技術是一種在單細胞水平上分析基因組、轉錄組及表觀遺傳的強大的方法，近幾年來，測序技術方面已取得了大量突破。2013年，首次利用SCS技術對腫瘤病人單個外周血循環腫瘤細胞進行全基因組、外顯子組測序，為無創腫瘤診斷和監測提供了一種新的技術手段[2]。

2 單細胞測序技術原理[3-8]

單細胞測序技術主要包括單細胞基因組測序、轉錄組測序、表觀遺傳學測序及多組學測序。

2.1 單細胞基因組測序

對目的細胞的全部基因組序列進行非選擇性、均勻擴增，隨后進行高通量測序，進而在全基因組水平上研究腫瘤進化、配子發生、體細胞嵌合現象。

2.2 單細胞轉錄組測序

對采集患者樣本的幾乎所有轉錄本進行測序，揭示了胚胎早期發育、細胞分化和細胞重編等過程中的動態基因表達和相關的基因調節網絡。

2.3 各種表觀遺傳學測序

表觀遺傳學是描述基因組功能上的相關改變，不涉及非致瘤性單細胞核苷酸序列的改變，能更準確描述單個腫瘤細胞的基因組命運。表觀遺傳包含細胞中所有遺傳標記及其染色體的表型，定義細胞發育和癌癥進展的每個階段進而決定了細胞的異質性。其中單細胞甲基化組測序剛剛起步，為個性化腫瘤治療提供依據，在癌癥和干細胞研究中顯示出巨大潛力。

2.4 多組學測序

同時進行單細胞基因組和轉錄組兩組測序，可以采用微流體的方式將兩者分離進行測序或者采用物理方法將兩者分離測序。也可同時進行三重組學的測序，從而可以同時得到來自同一細胞的基因組、轉錄組和DNA甲基化的信息。還有許多其他方面的測序嘗試仍在繼續。

3 單細胞測序技術方法

單細胞測序技術主要包括以下4個步驟：單細胞分離獲取，DNA或RNA序列擴增，基因測序及數據分析。

在五原鹽堿地治理的過程中，各企業、院校、科研機構以土地流轉的形式參與到鹽堿地治理中，其中以硅谷肥業尤為突出，共計流轉3000多畝土地，其中包括800多畝輕度鹽堿土地、1000多畝中度鹽堿土地、1200畝核心重度鹽堿土地。硅谷公司采取多種肥料結合，多種施肥方案，多種作物種植等方式，針對流轉區域進行改良，并取得顯著成效。同時，硅谷肥業還在五原的豐裕辦事處、新公中鎮、復興鎮等實施惠農措施，并開展了多個鹽堿治理示范園區。硅谷有機硅功能肥在五原縣鹽堿地改良治理的成功獲得了農業農村部耕保中心和多個省、市、地區的農業技術及相關部門、科研機構的關注。

3.1 單細胞分離獲取[9-15]

單細胞標本傳統上是從腫瘤組織或體液的活檢中獲得的，為了從大量混雜細胞中分離出目標細胞需要選擇以下方法（無限稀釋法、單細胞顯微鏡操作法、流式細胞儀分選細胞法、激光捕獲顯微切割法、微流控技術等），這些方法各有利弊，要根據具體的情況進行方法的選擇。

3.1.1 無限稀釋法

將目的細胞群從新鮮組織中分離出來，然后放入懸浮液中，進行倍比稀釋，直至獲得單個目的細胞。該方法的局限性在于操作員對技術的掌握程度，分離多個細胞的較高概率以及較低的獲取率。

3.1.2 單細胞顯微鏡操作法

在高倍鏡下分選細胞，但有操作難度大，獲取數量較少的缺點。

3.1.3 流式細胞儀分選細胞

通過熒光標記，根據細胞各自的特性，分選單個細胞或細胞群的技術。

3.1.4 激光捕獲顯微切割

利用激光脈沖將目標切片附在有熱塑膜的涂片上，進而實現細胞分離。主要應用于癌癥單細胞的分離研究。

3.1.5 微流控技術

利用微流控芯片上的微管道進行多種單細胞分選。這種方法可以批量測序所有的基因，從而降低了單細胞測序的成本，提高了測序效率，同時也方便了研究者。因此，微流控技術是目前最理想的單細胞分離方法，具有廣闊的應用前景，值得進行規模化的推廣和應用。

3.2 DNA或RNA序列擴增

由于現階段任何測序技術都無法直接對單個細胞提取的微量核酸進行檢測，故必須通過全基因組擴增和全轉錄組擴增技術，獲取到足量的核酸，從而構建DNA或RNA文庫，為分析基因突變和拷貝數改變以及確定單個細胞中特定的細胞基因表達提供了基礎。測序結果的正確與否取決于單細胞DNA和RNA擴增的數量和質量，所以DNA和RNA擴增方法的選擇顯得尤其重要。

3.2.1 全基因組擴增

將單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，通過外顯子捕獲進而高通量測序用于揭示細胞群體差異。常見的方法有聚合酶鏈反應法（PCR）、多重置換擴增技術（MDA）。PCR法是第一個針對SCS開發的方法但擴增效率低，MDA法已被廣泛報道，從單細胞基因組或外顯子組可以獲得高的物理覆蓋率（＞90%），這是測量堿基突變的理想方法[16]。近年，又有一種方法，Stepanauskas[17]等提出了一種組合M D A 和FA C S 并改進的方法，即WGA-X。該方法增強了單個微生物細胞和病毒基因組回收效率。

3.2.2 全轉錄組擴增技術

全轉錄組擴增技術是SCS的關鍵步驟，RNA測序的第一步是開發有效的全轉錄組擴增方法。單細胞轉錄組擴增的方法主要有唐氏法（Tang's method）、Smart-seq1、Smartseq2、線性擴增法等。但SMART技術不穩定，低水平表達的轉錄組可能會丟失[18-19]。在過去的幾年里，擴增技術取得了很大的進展，單個細胞轉錄組擴增技術中存在的弊端逐漸被修復。

3.3 基因測序

利用各種測序方法，分析DNA或RNA堿基序列、基因的表觀遺傳修飾。

3.4 數據分析

數據分析是指通過各種算法對測序結果進整理篩選，從測序結果中獲取有用信息的一種方法。目前單細胞測序技術仍存在多種固有技術錯誤，改進生物信息學分析技術是關鍵。隨著技術不斷發展，SCS技術及其在腫瘤個體化治療中的應用前景廣泛[20]。

4 單細胞測序在乳腺癌中的應用進展

4.1 揭示乳腺癌細胞的異質性，指導個體化治療

2017年chung等[21]分析了來自11名患者的515個細胞。從單細胞RNA-seq數據中推斷出的拷貝數變化，從而將癌細胞與非癌細胞區分開。在單細胞分辨率下，乳腺癌細胞在腫瘤內表現出一部分相同的特征，以及發現了與乳腺癌亞型和關鍵的腫瘤通路有關的瘤內異質性。大多數非癌細胞是免疫細胞，有三種不同的T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞。T淋巴細胞和巨噬細胞均表現出免疫抑制特征：T細胞具有調節或衰竭表型，巨噬細胞具有M2表型。這些結果說明乳腺癌轉錄組具有廣泛的瘤內異質性，瘤內異質性是導致臨床治療無效的原因之一[22]。因此了解乳腺癌異質性水平以及微環境基因表達可能有助于確定更好的預后和治療的分子靶點，進行精準治療。

4.2 分析乳腺癌轉移和進展

循環腫瘤細胞（CTC）來源于原發腫瘤，通過循環遷移到其他部位從而導致腫瘤患者大部分死亡。2015年，Lawson等[23]利用單細胞測序對不同分期的轉移性乳腺癌進行基因表達分析，揭示了原發腫瘤，CTCs和轉移癌細胞的個體基因組的之間的關聯。對 CTCs 進行單細胞測序主要具有兩大應用價值：一是操作過程更加簡化且得到純度更高的腫瘤細胞；二是對樣本質量的要求更低，能夠對所含有的微量DNA或RNA做出精準分析。總而言之，單細胞測序檢測CTCs能更好的提示轉移性乳腺癌患者的預后和對治療的反應[24]。

4.3 探索乳腺癌耐藥機制

由于腫瘤耐藥而復發的患者不計其數，這也是腫瘤治療無效的原因之一。三陰性乳腺癌（TNBC）是一種侵襲性亞型腫瘤，常發生化療耐藥。2018年，Kim等[25]使用了單細胞DNA和RNA測序對20例三陰性乳腺癌患者的化療前和化療后的腫瘤組織進行測序，結果表明，耐藥基因型是預先存在的，但腫瘤細胞的耐藥表達譜是在化療后經轉錄重編碼而獲得的。這個發現對于克服乳腺癌的化療耐藥及尋找新的治療靶點具有積極作用。

5 小結與展望

隨著單細胞測序技術的發展，在探尋乳腺癌的異質性，進化過程，轉移及耐藥性等方面成為有力的工具。但目前單細胞測序技術對乳腺癌的研究尚且單一，不能完整的揭示整個腫瘤的發生發展、轉移及耐藥的過程，突破單細胞甲基化組測序是我們新的方向。我們目前為止所討論的單細胞測序技術只能描述遺傳信息的一個維度，我們希望未來有望利用在單細胞水平進行基因組、轉錄組、表觀基因組等多種組學的綜合研究合并分析，從而更加系統全面地分析乳腺腫瘤細胞的基因變化，有助于臨床中對乳腺癌患者的個體化靶向治療，提高療效，實現個體化精準醫療。