鹽酸川芎嗪通過mTOR信號通路和凋亡通路抑制前列腺癌PC-3細胞的增殖研究

田小娟，張 靜

（漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462002）

根據相關醫學研究顯示，在前列腺疾病治療方面具有重要作用的物質是PI3K/Akt/mTOR信號通路，其中的雷帕霉素靶蛋白能夠在細胞存活和生長的過程中完成自身的控制和引導作用，有效調節不同細胞包括存活、增殖。

1 實驗材料

材料準備需要前列腺癌PC-3細胞株，并且保證其中含有10%的FBS，放置于CO2的飽和濕度敷箱培養，培養溫度為37℃；

前列腺上皮細胞RWPE-1細胞，RWPE-1細胞在含0.05 mg/ml BPE和5ng/ml EGF的K-SFM，培養溫度為37℃；

人結直腸癌細胞HCT-116細胞株，培養環境為含有10%的FBS（Hyclone），100 U/ml 青霉素，100 U/ml鏈霉素的DMEM（High Glucose）中，培養溫度為37℃；

2 實驗方法

2.1 MTT檢測細胞增殖

（1）96孔板接種細胞：PC-3和RWPE-1、HCT-116接種濃度為5000個/孔、2000個/孔。每9個實驗組為96孔板，每一個孔板上有6個復孔。其中的培養要求是0.25%胰酶-EDTA能夠在常規環境中完全消化，并且成為單個細胞懸液。培養的要求為CO2的飽和濕度敷箱培養，培養溫度為37℃，培養時間為24小時。

（2）刺激細胞：次日鹽酸川芎嗪干預細胞，刺激濃度依次為0、0.5、1.3、2.5、3.5、4.9、6.2、8.4 mM。培養的要求為CO2的飽和濕度敷箱培養，培養溫度為37℃，培養時間為72小時。

（3）呈色：在上述步驟進行之后，在培養容器中添加5 mg/ml的MTT溶液20 ul（每孔劑量），并且保證培養環境的穩定和正常，此次的培養時間為3小時左右。在此基礎上，將上清液吸走，并且在培養孔中添加150 ulDMSO。值得注意是添加此類試劑之后，液體中極易出現沉淀物，需要將試管輕輕晃動，保證添加劑能夠充分溶解。

（4）比色：用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定各孔的吸收值，制成Excel表格，進行統計。

以上的實驗環境需要重復三次，保證實驗結果的準確和有效。

2.2 Western blotting檢測凋亡相關蛋白，mTOR蛋白及其下游關鍵蛋白及其磷酸化蛋白的表達

（1）SDS-PAGE凝膠電泳

灌分離膠：TEMED加入的計量與分子量的不同配置不同濃度之間具有密切的關系。在灌膠的過程中應當保證灌膠的速度，在灌膠高度在容器5.5 cm左右即可停止。進而使用雙蒸水緩慢封閉，在操作的過程中應當保證動作的輕柔，結束操作之后將其放置，并且自由凝固，時間為30 min。

灌濃縮膠：30 min自由凝固結束之后，觀察容器中水和膠水之間中存在一條明顯的折線就能夠證明膠水已經凝固。這種情況下可以傾倒上層水，之后使用濾紙吸干水分。將配好的濃縮膠快速灌入，結束操作之后將其放置，并且自由凝固，時間為30 min。

上樣，加入蛋白樣本。

電泳，根據目的蛋白的分子量調節電壓。當電泳至膠的下緣時停止電泳。

（1）蛋白轉膜

切膠：電泳完畢后，將玻璃板放入水中小心撬開，把膠取出，參照marker按照目的蛋白的分子量大小切膠，切完之后測量長和寬，放入新配置的轉膜緩沖液中室溫搖晃。

剪膜和濾紙：換新的清潔干燥的一次性手套，依照膠的長和寬裁剪PVDF膜和濾紙。首先將剪好的PVDF膜放在甲醇中活化30 s，然后將活化的PVDF膜和濾紙放入轉膜緩沖液中室溫搖晃15 min。

（2）一抗孵育

磷酸化一抗稀釋液：5%的牛血清白蛋白（TTBS稀釋）；非磷酸化一抗稀釋液：1%的牛奶（TPBS稀釋）。將膜放入加了一抗的稀釋液中，置于4℃冰箱緩慢搖床，放置12小時。

（3）二抗孵育

24小時之后，將膜取出用磷酸化或非磷酸化漂洗三次，每次十分鐘。磷酸化二抗稀釋液：3%的牛奶稀釋；非磷酸化二抗稀釋液：3%的牛奶稀釋，將膜放入加了二抗的二抗稀釋液中，室溫慢搖3小時。孵育完畢后用磷酸化或非磷酸化漂洗三次，每次十分鐘。

（4）化學發光，顯影

按照試劑的相關說明將其中的發光試劑混合，并且盡量保證試劑能夠溶解均勻。

2.3 m7GTP 瓊脂糖珠 pulldown檢測

2.3.1 細胞準備

對于PC-3細胞，0.25%胰酶-EDTA進行常規消化，PC-3和RWPE-1、HCT-116接種濃度為5000個/孔、2000個/孔。每9個實驗組為96孔板，每一個孔板上有6個復孔。45萬個細胞/瓶。并且將以上的細胞進行24h刺激，換取新鮮培養基并加入鹽酸川芎嗪，使其終濃度分別達到4.9、6.2、8.4mM，持續培養時間為24小時。

2.3.2 蛋白樣品的制備

（1）保證培養時間超過24 h，對細胞進行沖洗，沖洗使用的試劑是4℃預冷的PBS。每瓶細胞將PBS盡量吸棄干凈，而后加入200 ul含蛋白酶抑制劑的RIPA，冰上裂解20 min。

（2）在上述工作完成之后，使用等移液槍緩慢將細胞碎片吹打至瓶底一角（稱為裂解蛋白液），在裂解蛋白液的過程中應當保證不要氣泡。將裂解之后的試劑放在冰上靜置10 min左右，與此同時將離心機4℃預冷。

（3）將裂解蛋白液移至EP管內，放入預冷的離心機中，12000 r，30 min心，同時打開紫外分光光度儀進行初始化。

（4）上述實驗步驟完成之后，將上清液轉移到新的EP管內，注意標記。從三個EP管中各吸取2 ul的樣本各加入到2 ml考馬斯亮藍G250中充分混勻，并且靜置反應10 min。

（5）取3×10 ul共三管，用不含蛋白酶抑制劑的RIPA洗3次，在上述步驟進行之后，在培養容器中添加5 mg/ml的MTT溶液20 ul（每孔劑量），并且保證培養環境的穩定和正常，此次的培養時間為3小時左右。在此基礎上，將上清液吸走，并且在培養孔中添加150 ul DMSO。需要將培養皿放在搖床上輕輕搖動，保證其中的試劑能夠充分溶解。

2.3.3 蛋白樣品的制備

（1）在以上工序完成4 h之后，把三個EP管均放置在4℃預冷的離心機中，清洗EP管，清洗劑使用含蛋白酶抑制劑的RIPA。清洗的時間階段為3分鐘一次。

（2在）三個EP管中分別加入2×SDS+β-硫基乙醇25 ul，在加入之前根據實驗室內的溫度進行適當預熱，將以上的試劑于沸水中煮10 min，備用。

3 實驗結果

3.1 細胞增殖的檢測

MTT檢測刺激濃度依次為0、0.5、1.3、2.5、3.5、4.9、6.2、8.4 mM的鹽酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3細胞48 h和72 h，對人體結腸直腸癌細胞HCT-116和前列腺上皮細胞RWPE-1刺激在48 h小時之后細胞出現的變化情況，由此可見不同濃度的鹽酸川芎嗪對于RWPE-1進行刺激的效果并沒有明顯的變化，即（P＞0.05）。其中細胞具有明顯改善和變化的是7.2mM濃度以上的鹽酸川芎嗪，與此同時1.2 mM的鹽酸川芎嗪對于腫瘤細胞PC-3細胞和HCT-116的抑制作用也是十分明顯的，這就能夠判斷出腫瘤細胞對于鹽酸川芎嗪的刺激作用具有較為明顯的依賴性。不同濃度的鹽酸川芎嗪對于腫瘤細胞的影響存在一定的時間和濃度的關聯性和依賴關系，在刺激時間在48h和72h狀態下，IC50分別為7.2 mM和4.8 mM。

3.2 Western blotting檢測mTOR蛋白和下游關鍵蛋白及其磷酸化蛋白的表達

根據Western blotting檢測結果能夠表現出，在相同的環境背景下，4.8 mM、7.2 mM的鹽酸川芎嗪對于p-mTOR的表達都具有明顯的影響作用，并且應用在p-p70S6k、p-S6、p-4E和p-4E-BP1的表達的影響上效果相同，其中（P＜0.01）。但是鹽酸川芎嗪對于mTOR、p70S6、S6、4E的表達影響下并沒有明顯的關聯性和統計學意義（P＞0.05），由此可見，鹽酸川芎嗪可能通過抑制mTOR及其下游相關蛋白的磷酸化水平發揮作用。

4 結束語

鹽酸川芎嗪在世界范圍內的臨床診療中具有廣泛并且良好的使用效果，由于在治療的過程中副作用較小，進而成為了醫生們使用的高頻藥物。近年來，鹽酸川芎嗪逐漸被發現在治療前列腺腫瘤的治療中具有良好的效果，但是其中存在的安全隱患和局限性仍舊未能得到良好的整合和研究。在診療過程中使用抗雄激素療法能夠取得相應的治療成效，然而患者在接受診療的過程中經常出現對激素治療的抵抗現象，進而影響了前列腺治療的穩定性和有效性。長時間內對于治療前列腺的方式方法均沒有穩定的界定和實施，進而逐漸成為前列腺疾病治療的關鍵性難題。鹽酸川芎嗪通過mTOR信號通路和凋亡通路抑制前列腺癌PC-3細胞具有良好的診療效果，值得在臨床中廣泛使用。