流式細胞術檢測細胞周期實驗條件的影響因素分析

沈鏈鏈，鐘義紅，熊建平，劉艷青

(南京醫科大學公共衛生學院，江蘇 南京 211166)

流式細胞術(FCM)能夠對單細胞進行定量分析與分選，通過對細胞內化學成分的檢測獲取細胞內各種生命物質的參數，為細胞生物學、生物醫學提供全新的技術支持[1]。細胞周期是指以有絲分裂方式增殖的細胞從親本分裂結束到子細胞分裂結束所經歷的過程。FCM是檢測細胞周期分布情況的最佳方法[2]，可為細胞周期的動力學研究提供有力的分析手段。用FCM檢測細胞周期的實驗步驟雖然不多，但存在實驗結果不穩定(平行性不好)，固定效果不好，變異系數(CV)過大等一系列問題，尤其是處理過的、狀態不佳的細胞。因此，本實驗利用細胞周期阻滯劑秋水仙素處理結腸癌細胞株(HCT116)，研究FCM檢測過程的各個環節對結果的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

HCT116人結腸癌細胞株(中國科學院生物化學與細胞生物學研究所)；1640培養基、胰酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(以色列BI公司)；秋水仙素(愛必信上海生物科技有限公司)；BD FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)；碘化丙啶PI染色液(含RNase)細胞周期試劑(美國BD公司)。

1.2 分組設置

1.2.1 固定方式對結果的影響 HCT116細胞于培養皿中過夜培養；待細胞貼壁后鋪滿60%～70%，更換為含有秋水仙素的培養液，細胞經終濃度為1.25 μmol/L的秋水仙素刺激16 h后，收集全部培養液(含貼壁不牢的細胞)。貼壁細胞經胰酶消化后，與培養液混合，1 000 r/min離心5 min，加入適當培養液稀釋，細胞計數后每份樣本取1×106個細胞至離心管，PBS洗1次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液后分別按下列3種方式固定：緩慢逐滴滴入預冷的70%乙醇2 mL；一邊渦旋一邊加預冷的70%乙醇2 mL；經0.6 mL PBS吹散細胞后再加1.4 mL預冷的純乙醇(均為3個平行，共9個樣本)。4℃固定過夜后，1 500 r/min離心5 min，PBS洗2次，1 500 r/min離心5 min，加0.5 mL細胞周期試劑，避光15 min后300目濾網過濾，上機。

1.2.2 細胞數量對結果的影響 細胞加藥處理同“1.2.1”。細胞計數后每份樣本分別取1×106、0.33×106、0.5×106、2×106和5×106個細胞至離心管(均為3個平行，共15個樣本)，PBS洗1次，1 000 r/min離心5 min后按“1.2.1”中的第3種方式固定，4℃過夜后，PBS洗、染色步驟同“1.2.1”。

1.2.3 固定溫度對結果的影響 細胞加藥處理同“1.2.1”。細胞計數后每份樣本取1×106個細胞至離心管，PBS洗1次，1 000 r/min離心5 min后按“1.2.1”中的第3種方式固定，分別放置于4℃過夜、-20℃過夜、4℃放置6 h后于-20℃過夜和常溫過夜(均為3個平行，共12個樣本)。第2天，PBS洗、染色步驟同“1.2.1”。

1.2.4 固定時間對結果的影響 細胞加藥處理同“1.2.1”。細胞計數后每份樣本取1×106個細胞至離心管，PBS洗1次，1 000 r/min離心5 min后按“1.2.1”中的第3種方式固定，分別放置于-20 ℃ 1 d(過夜)，28 d，56 d，70 d(均為3個平行，共12個樣本)。固定后，PBS洗、染色步驟同“1.2.1”。

1.2.5 染色時間對結果的影響 細胞加藥處理同“1.2.1”。細胞計數后每份樣本取1×106個細胞至離心管，PBS洗1次，1 000 r/min離心5 min后按“1.2.1”中的第3種方式固定，4℃過夜，PBS 洗，加0.5 mL細胞周期試劑染色，分別于染色15 min后放置0、1、2、4、8 h檢測(均為3個平行，共15個樣本)。

1.3 上機檢測

用流式細胞儀檢測樣本，以FSC-H為橫坐標，SSC-H為縱坐標，設置門R1，以FL2-A為橫坐標，FL2-W為縱坐標，設置門R2，總共收集R2門內20 000個細胞。

1.4 細胞周期結果分析

Modfit 軟件分析，得出各個期細胞百分比及CV值。

1.5 數據統計

2 結果

2.1 固定方式的影響

3種固定方式的檢測結果見表1。“70%冷乙醇在渦旋儀上加入”組的CV值大于“70%冷乙醇逐滴加入”組，且差異有統計學意義，而 “PBS和純乙醇(3 ∶7)”組與“70% 冷乙醇逐滴加入” 組的差異無統計學意義。但從散點圖(圖1)看，“PBS和純乙醇(3 ∶7)”組的固定效果最好，表現為細胞群最集中。因此在后續的實驗中，均采取PBS和純冷乙醇(3 ∶7)的方法固定。

固定方式G1期(%)G2期(%)S期(%)CV(%) 70%冷乙醇逐滴加入1.71±0.2190.50±0.657.79±0.746.71±0.12 70%冷乙醇在渦旋儀上加入1.64±0.2891.57±0.636.80±0.367.23±0.03a PBS和純冷乙醇(3 ∶7)1.94±0.0789.90±0.288.16±0.326.81±0.10 F值1.8777.2005.69828.730 P值0.2330.0250.0410.001

a：P<0.05，與“70%冷乙醇逐滴加入”組相比

A：70%冷乙醇逐滴加入；B：70%冷乙醇在渦旋儀上加入；C：PBS 和純冷乙醇(3 ∶7)

圖1 3種固定方式的樣本Modfit分析圖

2.2 細胞數量的影響

見表2。細胞數量不同會在一定程度上影響結果，當細胞數為標準數量的1/3時，CV值比標準數量組大，且差異有統計學意義，可能影響數據的可信度。當細胞數為標準數量的1/2時，G2期的比例較標準數量組大，且CV值增大，差異有統計學意義。當細胞數達到標準數量的2倍時，G2、S期的比例改變(P<0.05)，且CV值明顯增大(P<0.05)。當細胞數達到標準數量的5倍時，雖然各期值的變化無明顯差異，但CV值明顯增大，可能與試劑量相對于細胞數量而言不夠、染色不充分有關。從圖2可見，細胞數太多或太少時，曲線極不平滑或G2峰出現了雙峰，數據可信度降低。因此，取細胞數為1×106進行后續實驗。

2.3 固定溫度的影響

與4℃組相比，-20℃組、“4℃～-20℃”組的檢測結果及CV值差異無統計學意義。常溫組G2期、S期的比例與4℃組相比，差異有統計學意義，見表3。因此固定后的樣本不能放置于常溫。

2.4 固定時間對結果的影響

由表4可見，28 d組，56 d組，70 d組的各期比例與1 d組相比，差異均無統計學意義；CV值明顯增大(P<0.05)，但并無隨固定時間逐漸增大的趨勢。

細胞數G1期(%)G2期(%)S期(%)CV(%) 1×1065.60±0.1179.90±0.9014.50±0.997.19±0.16 0.33×1065.23±0.2881.29±0.9713.48±1.248.95±0.62a 0.5×1064.65±0.2281.46±0.34a13.89±0.528.00±0.21a 2×1066.05±0.1983.43±0.33a10.52±0.52a8.67±0.12a 5×1066.48±1.3380.57±0.4212.95±0.959.33±0.16a F值3.89312.2878.90321.897 P值0.0370.0010.0020.000

a：P<0.05，與1×106細胞數組相比

A：1×106；B：0.33×106；C：0.5×106；D：2×106；E：5×106

表3 不同固定溫度的檢測結果

a：P<0.05，與4℃組相比

固定時間G1期(%)G2期(%)S期(%)CV(%)1 d0.75±0.0586.78±0.7012.47±0.748.00±0.1628 d1.14±0.5487.48±0.6611.38±1.048.88±0.18a56 d0.87±0.1187.73±1.1011.40±1.118.78±0.41a70 d1.03±0.1687.53±0.6211.44±0.478.73±0.06aF值1.0600.8021.1038.422P值0.4180.5270.4030.007

a：P<0.05，與1 d組相比

2.5 染色時間對結果的影響

由表5可見，1 h、2 h組與0 h相比，各期比例及CV值無有統計學意義的改變。4 h組G2期的比例比0 h明顯降低(P<0.05)。8 h組G1期的比例較0 h明顯升高，CV值明顯增大，差異有統計學意義(P<0.05)。因此，染色完成后需在2 h之內完成檢測。

染色時間G1期(%)G2期(%)S期(%)CV(%)0 h0.98±0.0590.39±0.188.63±0.237.87±0.101 h1.36±0.2690.48±0.198.16±0.448.23±0.432 h1.12±0.0890.22±0.498.66±0.568.19±0.154 h1.34±0.2289.01±0.73a9.65±0.808.36±0.25

(續表5)

a：P<0.05，與0 h相比

3 討論

細胞周期檢測看似簡單，但是要獲得可信和穩定的結果卻并不容易。本實驗從固定方法、細胞數量、固定后存放溫度，固定后存放于-20℃的時間，以及染色時間等多方面探討其可能的影響因素。

最常用、簡單的固定方式是在細胞沉淀中直接加入70%冷乙醇固定，但從本實驗結果來看，用PBS吹成單細胞懸液后再加預冷純乙醇的方法能獲得更好的效果，該方法也曾有文獻報道[3]。PBS吹散細胞沉淀后加入純乙醇(兩者比例為3 ∶7)是筆者推薦的方法，其原因可能是PBS吹散后形成單細胞懸液，從而使單細胞更加快速地與乙醇接觸，所以固定效果更好。該方法對于狀態不佳的細胞樣本(如轉染后的細胞等)的實驗結果有很好的改善作用。另外，董波等[4]認為，固定細胞的過程中加入終濃度為 3%的小牛血清是一種簡單的、能有效地保護細胞膜使細胞不易粘連的技術措施。

按照試劑盒說明書的要求，每份樣本應含有1×106細胞，而在實際工作中，由于每個樣本計數太耗時而未做計數或者一份樣本的全部細胞都不夠1×106等原因，導致樣本間的細胞數量差異很大。從我們的實驗結果來看，細胞數的差異影響檢測結果以及CV值。因此，每份樣本均應計數，與試劑盒要求一致，避免由此引起的誤差。胡夢裳等[5]的實驗結果表明，碘化丙啶濃度在一定范圍內的變化并不影響檢測的各期百分比的數值。而本實驗結果表明，同樣劑量的試劑，不同的細胞數，對各期的百分比有一定的影響，但影響最大的還是CV值。唐國華等[6]報道，每秒進樣細胞數影響各期的百分比。在我們的實驗中，雖然都使用低速上樣，但由于樣本的細胞濃度不同，導致每個樣本的每秒上樣細胞數目不同，也可能是導致結果差異的原因之一。

由于固定后短期存放于4℃或-20℃無差異，因此建議可以直接將樣本放入-20℃，過夜后檢測或長期存放均可。-20℃存放70 d之內檢測僅對CV值稍有影響，對各周期的細胞百分比無明顯影響。有學者認為固定20 min[7]或30 min[3]即可，且結果與固定較長時間(18 d)的結果類似。這也說明，只要固定所使用的試劑以及操作正確，固定后的細胞狀態非常穩定，固定時間對結果的影響并不明顯。

染色完成后2 h檢測對結果影響不大，若樣本太多，而且樣本細胞數太少，應進行分批染色，減少染色后的等待上機時間。

總的來說，用流式細胞術檢測細胞周期時，細胞數應遵照試劑盒要求，推薦用PBS吹散加入預冷的純乙醇固定，固定后置于-20℃，70 d內用周期試劑染色，染完后2 h內上機檢測。