靶向PD-1 的多肽阻斷劑的設計及評價

全麗娜， 刁妍妍， 李 巧， 李文杰， 朱麗麗， 李洪林

（華東理工大學藥學院，上海市新藥設計重點實驗室，上海 200237）

癌癥是威脅人類身體健康的重要疾病之一，目前由于癌癥的治愈率極低，因此癌癥被人們稱之為“絕癥”。根據癌癥的類型、生長位置以及發病程度，癌癥的治療方法分為很多種，包括手術切除、放射療法、化學療法和靶向治療[1]，但這些治療方法均具有一定的局限性。免疫療法于1997 年第一次用于治療癌癥，現已成為科學家們重要的研究方向[2]。在各種免疫治療的方法中，免疫檢查點療法近幾年來取得了顯著療效。

程序性死亡受體1（Programmed Death 1，PD-1）是目前研究相對成熟的免疫檢查點之一[3]。PD-1，又名CD279，是CD28 家族中的一個負性協同刺激分子受體，是由288 個氨基酸組成的免疫球蛋白超家族I 型跨膜糖蛋白[4]。它有兩個內源性配體，分別為PD-L1 和PD-L2。PD-1 與PD-L1 或PD-L2 結合，可以激活其在T 細胞內的抑制信號通路，傳遞負性共抑制信號給T 細胞，影響T 細胞相關基因表達，干擾細胞增殖、活化，甚至誘導T 細胞凋亡，最終造成腫瘤細胞的免疫逃逸[5]。PD-1/PD-L1 通路形成的抑制信號具有可逆性，利用藥物阻斷PD-1/PD-L1 通路可以重新激活衰竭的T 細胞，通過腫瘤浸潤T 淋巴細胞殺傷腫瘤細胞，逆轉腫瘤誘導免疫抑制效應，因此針對該通路的免疫治療具有理論可行性[6]。目前，已有多種阻斷PD-1/PD-L1 相互作用的單克隆抗體應用于腫瘤治療和臨床試驗，并且呈現出顯著的療效，如靶向于PD-1 的抗體Pembrolizumab 和Nivolumab，靶向于PD-L1 的抗體Atezolizumab、Durvalumab 和Avelumab 均逐漸被獲批應用于各種實體瘤的臨床治療[7]。但是單克隆抗體藥物具有生產成本較高、穩定性低、存在一定的免疫原性等缺點，這使得抗體藥物的應用受到了極大的限制。

斯坦福大學醫學院Ring 課題組于2015 年發表的一篇文章表明低分子量的非抗體類藥物可用于PD-1/PD-L1 介導的免疫治療和診斷[8]。鄭州大學高艷鋒課題組利用噬菌體展示的方法篩選得到了一種靶向PD-L1 的不易水解的D 型多肽阻斷劑，并驗證了該多肽阻斷劑可以阻斷PD-1/PD-L1 相互作用[9]。中科院納米技術與納米仿生研究所朱毅敏研究團隊首次利用細菌表面展示方法篩選得到了靶向于PDL1 的多肽阻斷劑TPP-1，驗證其具有阻斷PD-1/PDL1 信號通路和抑制腫瘤細胞生長的作用[10]。多肽阻斷劑具有開發生產成本低、穩定性好、較高的組織和腫瘤滲透性等優點，但目前鮮見靶向于PD-1 的多肽阻斷劑進入臨床。因此，研究靶向于PD-1 的多肽類阻斷劑具有很好的前景。

基于上述理論支持及實踐經驗，我們課題組也致力于開發靶向PD-1/PD-L1 免疫檢查點的多肽阻斷劑。前期我們利用從頭設計多肽的方法設計了一系列靶向于PD-1 的多肽阻斷劑[11]，其中多肽Ar5Y_4與PD-1 的結合親和力（KD）值為1.38 μmol/L。本文在多肽Ar5Y_4 的基礎上截去其C 末端5 個氨基酸，得到結合親和力更高的多肽阻斷劑P5-1，并分析其阻斷PD-1/PD-L1 結合能力，評價其對T 細胞分泌IL-2水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株與細胞 PD-1 基因購于北京義翹神州科技有限公司（貨號：HG10377-M），載體pET28a、感受態菌株E.coli DH5α 與菌株E.coli BL21(DE3)均由實驗室保存。質粒pET28a-PD-1(34-150)由本實驗室構建[11]。Jurkat 細胞和BxPC-3 細胞來源于美國菌種保藏中心（ATCC）。

1.1.2 試劑 DNA marker 購買于北京全式金生物技術有限公司；氨基偶聯試劑盒、醋酸鈉（pH 4.5）緩沖液和CM5 芯片購買于GE Healthcare 公司；植物血凝素（PHA）、丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）購買于Sigma公司；阻斷型抗PD-1 單克隆抗體（貨號：16-9989）與人IL-2 ELISA 檢測試劑盒(貨號：BMS221/2)購買于eBioscience 公司；PD-L1 蛋白（貨號：10084-H08H）購買于北京義翹神州科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靶向于PD-1 多肽阻斷劑的設計及優化 前期我們利用計算機從頭設計多肽的方法設計了一系列靶向于PD-1 的多肽阻斷劑[11]，利用Rosetta 的Interface Analyzer 模塊進行打分得到多肽Ar5Y_4，其氨基酸序列為GNWDYNSQRAQLYNQ。Ar5Y_4 與PD-1的結合模式如圖1 所示，從圖中可知，Ar5Y_4 上的氨基酸殘基與PD-1 蛋白形成一定的相互作用，分別為：鹽橋（D4-K78、R9-E136），氫鍵作用（W3-K78、W3-E84、Y5-E136、R9-Y68、R9-E136）和疏水相互作用（ Y5-Y68、 Y5-I126、 Y5-I134、 Y5-E136、 Y13-A132、Y13-I134）。從該結合模式的分析結果可得，Ar5Y_4 與PD-1 之間的結合親和力大部分由W3、D4、Y5 和R9 4 個關鍵錨點（anchor）殘基提供。另外，Ar5Y_4上C 末端的5 個氨基酸形成α 螺旋并且處于結合位點外面，可能該部分序列不利于Ar5Y_4和PD-1 的結合。本文將Ar5Y_4 C 末端的5 個氨基酸截去以獲得多肽P5-1，其序列為GNWDYNSQRA，希望多肽P5-1 既能保留與PD-1 的結合能力，又可避免與PD-1 結合時產生的位阻效應。

圖 1 多肽Ar5Y_4 與PD-1 的預測結合模式[11]Fig. 1 Predicted binding mode of peptide Ar5Y_4 with PD-1

1.2.2 PD-1 重組質粒的構建、表達與純化 文獻[12]報道，將PD-1 的34～150 位氨基酸克隆于pET-28a載體中，并將第73 位半胱氨酸突變成絲氨酸，目的是增加PD-1 蛋白的表達量。選取克隆構建成功的重組質粒，將其轉化到表達宿主菌E.coli BL21(DE3)感受態細胞中進行PD-1 蛋白表達。在菌體吸光度值（OD 值）達到0.6 時，向TB（Terrific Broth）培養基中加入0.5 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導劑，并在37 ℃下誘導培養5～7 h。誘導后的大腸桿菌菌體收集后經高壓破碎，離心后取沉淀，此時PD-1 重組蛋白以包涵體形式存在于沉淀中。先用含有低濃度尿素的緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L尿素，φ 為2.5%Triton X-100，pH 8.0）洗去沉淀中大部分的雜蛋白，再用含有高濃度尿素的緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH 8.0）在室溫下溶解沉淀中的PD-1 蛋白。將PD-1 蛋白濃縮后加入復性緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L L-Arg（L-Arginine），24 mmol/L NaCl，1 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）中，用稀釋法于4 ℃下復性24 h。將復性后的PD-1 蛋白濃縮，并且在透析緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），pH7.7）中透析過夜。然后將復性后的PD-1 蛋白進行柱層析純化，分別使用陽離子交換層析（HiTrapTMSP FF）及凝膠過濾層析（Superdex 75 10/300）對PD-1 蛋白進行純化。最后通過十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE 電泳）檢測純化后PD-1 蛋白的純度。

1.2.3 多肽P5-1 與PD-1 蛋白結合親和力的測定 本文運用表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技術測定多肽P5-1 與PD-1 蛋白之間的結合親和力，實驗在BIAcore T200 儀器（GE Healthcare）上進行。首先將純化后的PD-1 蛋白用pH 4.5 的醋酸鈉溶液稀釋至50 μg/mL，再用偶聯試劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）將PD-1 蛋白偶聯在CM5 芯片上，流速為10 μL/min，結合時間為600 s，最后用乙醇胺封閉，最終PD-1 的偶聯量約為4 000 RU。偶聯完成后，利用運行緩沖液（10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液, 2.7 mmol/L KCl, 137 mmol/L NaCl 和φ 為0.005%表面活性劑P20, pH 7.4）沖洗芯片表面直至基線平穩，之后將多肽P5-1 用運行緩沖液溶解，并將其稀釋成一系列濃度梯度（0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L），將配制好的多肽以30 μL/min 的流速結合芯片上的蛋白90 s，解離120 s。實驗結果利用BIAcore T200 Evaluation 1.0 軟件進行穩態擬合。

1.2.4 多肽P5-1 的競爭性結合實驗 利用表面離子體共振（SPR）設計競爭性實驗，用于證明多肽P5-1 在結合PD-1 的同時可以阻斷PD-1 與PD-L1 的相互作用。首先將購買的PD-L1 蛋白凍干粉用超純水溶解并稀釋至1 mg/mL，然后用pH 4.5 的醋酸鈉溶液將PD-L1 蛋白稀釋至50 μg/mL，利用氨基偶聯的方法偶聯至CM5 芯片上，最終PD-L1 的偶聯量約為4 000 RU。用運行緩沖液沖洗芯片至基線平衡。將不同濃度的多肽P5-1（3.125, 0.780, 0.195, 0.045,0 μmol/L）與1 μmol/L PD-1 蛋 白 在 冰 上 混 合 孵 育30 min。多肽P5-1 與蛋白混合物隨運行緩沖液（10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液, 2.7 mmol/L KCl, 137 mmol/L NaCl 和φ 為0.05%表面活性劑P20, pH 7.4）流經芯片表面，流速為30 μL/min，結合時間90 s，解離時間120 s。運用BIAcore T200 Evaluation 1.0 軟件分析實驗結果。

1.2.5 ELISA 法檢測T 細胞中IL-2 的分泌水平 首先用500 U/mL 干擾素γ（IFN-γ）刺激BxPC-3 細胞48 h，目的是為了提高PD-L1 的表達[13]。然后在傳代的Jurkat T 細胞中加入2 μg/mL PHA 和20 ng/mL PMA共同刺激細胞4 h，用以激活Jurkat T 細胞[14]。換液除去Jurkat 培養液中的PHA 和PMA，以免影響細胞生長。將刺激過后的BxPC-3 細胞與激活的Jurkat 細胞以3∶1 的個數比在96 孔板中進行共培養，Jurkat細胞單獨培養作為對照。以阻斷型抗PD-1 單克隆抗體作為陽性對照，以D-hank’s 溶液作為陰性對照，實驗組加入50 μmol/L 多肽阻斷劑，在二氧化碳細胞培養箱中孵育48 h。收集上清培養基，離心后取上清，用ELISA 試劑盒檢測Jurkat 分泌于培養基中IL-2 的量。用不同濃度的IL-2 標準品繪制標準曲線，再由標準曲線得出樣品中IL-2 的總量。該實驗設置3 次平行實驗。

2 結果與討論

2.1 高純度的PD-1 重組蛋白的獲得

利用大腸桿菌系統表達PD-1 蛋白，通過包涵體變復性后獲得可溶性的蛋白，然后利用陽離子交換層析及凝膠過濾層析進行純化。純化后收集的PD-1 蛋白用SDS-PAGE 分析純度，如圖2 所示。由圖可見，PD-1 蛋白條帶位于10～15 ku，與PD-1 蛋白的理論分子量（約13 ku）相符，并且從電泳圖上可以看出，組分1 雜蛋白較多，組分2 和組分3 蛋白純度較高。收集組分2 和組分3 的樣品用于后續實驗。

2.2 多肽P5-1 靶向結合PD-1 蛋白

本課題組在多肽Ar5Y_4 的基礎上進行優化得到多肽P5-1，其氨基酸序列為GNWDYNSQRA。運用SPR 測定多肽P5-1 與PD-1 的KD值均為0.21 μmol/L（圖3），比PD-1/PD-L1 的KD值（1.15 μmol/L）高[15]，因此P5-1 有望阻斷PD-1 與PD-L1 的相互作用。

2.3 多肽P5-1 競爭性阻斷PD-1 與PD-L1 的結合

圖 2 經凝膠過濾層析純化后的PD-1 的SDS-PAGE 凝膠電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified PD-1 after size exclusion chromatography

圖 3 多肽P5-1 與PD-1 結合的SPR 圖Fig. 3 Binding analysis of peptide P5-1 with PD-1 by SPR

由上述SPR 實驗測得的多肽P5-1 與PD-1 之間的結合親和力可知，多肽P5-1 不僅可以結合PD-1，并且具有亞摩爾級別的結合親和力。為了探究多肽P5-1 與PD-1 結合的同時是否可以阻斷PD-1 與PD-L1的相互作用，我們又設計了基于SPR 的競爭性實驗，結果如圖4 所示，隨著多肽P5-1 濃度的增加，PD-1 與P5-1 的結合增加，游離的PD-1 濃度降低，從而使結合在PD-L1 上的PD-1 蛋白減少，最終導致響應值降低。因此，從該實驗結果可以表明，多肽P5-1 在分子水平上不僅可以結合PD-1，同時還可以阻斷PD-1與PD-L1 的結合。

圖 4 多肽P5-1 與PD-L1 競爭性結合PD-1 的SPR 實驗結果Fig. 4 SPR for peptide P5-1 and PD-1 with competitive binding assay

2.4 多肽P5-1 可恢復衰竭的Jurkat T 細胞分泌IL-2 的水平

當T 細胞上表達的PD-1 與腫瘤細胞上表達的PD-L1 通路形成后，會產生一種共抑制信號負性調控T 細胞的功能。細胞因子的產生是評價T 細胞功能的一個顯著的標志，而IL-2 與T 細胞的增殖和活化相關，因此我們在腫瘤細胞與T 細胞共培養體系中檢測T 細胞分泌細胞因子IL-2 的水平來評價T 細胞的功能，結果如圖5 所示。當激活后的Jurkat T 細胞與腫瘤細胞BxPC-3 共培養后，Jurkat 產生IL-2 的量明顯下降，約比原始值（第1 列）下降40%。因此，該結果表明，在共培養體系中，Jurkat 表面的PD-1 可以與BxPC-3 表面的PD-L1 相互作用，并且抑制T 細胞的活化，表現為Jurkat 分泌IL-2 的能力下降。而當加入多肽P5-1 后，Jurkat 分泌的IL-2 明顯增加，增加的量約為Jurkat T 細胞與BxPC-3 細胞共培養時分泌量（第2 列）的30%。本實驗將阻斷型抗PD-1 單克隆抗體（mAb）作為陽性對照（第4 列），加入陽性抗體后可以部分恢復Jurkat 分泌IL-2 的能力。該實驗結果說明多肽P5-1 可恢復衰竭的Jurkat T 細胞分泌IL-2 的水平。

圖 5 ELISA 法測定Jurkat 分泌IL-2 的水平Fig. 5 Measurements of IL-2 secretion in Jurkat cells by ELISA

3 結 論

本文利用大腸桿菌表達系統，重組表達了PD-1胞外區蛋白，并且純化得到純度較高的PD-1 蛋白。我們通過從頭設計多肽的方法設計靶向于PD-1的多肽阻斷劑，在前期多肽Ar5Y_4 的基礎上，截去C 末端5 個氨基酸得到多肽P5-1，并測得其與PD-1 的結合親和力為0.21 μmol/L，之后通過SPR 競爭性實驗證明多肽P5-1 可以阻斷PD-1 與PD-L1 的結合。在腫瘤細胞BxPC-3 與T 細胞Jurkat 共培養體系中，我們發現多肽P5-1 可以恢復Jurkat 分泌IL-2 的能力。多肽P5-1 是在多肽Ar5Y_4 的基礎上截去C 末端5 個氨基酸得到的，其結合親和力比多肽Ar5Y_4 高（多肽Ar5Y_4 與PD-1 的結合親和力為1.38 μmol/L）。分析原因如下：截去Ar5Y_4 的C 末端的5 個氨基酸而保留大部分的功能氨基酸，既可保證多肽與PD-1 形成相互作用，又可減少多肽與PD-1結合時產生的位阻效應，從而提高了多肽與PD-1 的結合親和力。本文為后續開發靶向于PD-1 的多肽阻斷劑奠定了基礎，并為靶向于PD-1 的抗腫瘤研究提供多肽候選藥物。