低強度脈沖超聲保護MPP+誘導N2a細胞損傷

陳雪瑩，楊 珂，王 冬 *，張 亮，王 穎2,，朱 慧，趙釹君，王志剛

(1.重慶醫科大學附屬第一醫院超聲科，重慶 400016；2.超聲分子影像重慶市重點實驗室，重慶 400010；3.重慶醫科大學附屬兒童醫院兒科研究所, 兒童發育疾病研究教育部重點實驗室, 兒童發育重大疾病國家國際科技合作基地,兒科學重慶市重點實驗室,重慶市干細胞治療工程技術研究中心，重慶 400014；4.重慶醫科大學附屬第二醫院超聲科，重慶 400010)

帕金森病(Parkinson disease， PD)是第二大常見神經退行性疾病，典型癥狀有靜止性震顫、動作遲緩、僵硬及平衡障礙等，主要歸因于黑質紋狀體系統中的多巴胺能神經元進行性死亡、缺失。在環境和遺傳共同作用下，線粒體功能障礙和氧化應激在PD發病過程中具有重要作用[1-2]。目前非侵入方法治療PD已顯示出良好的應用前景，如重復經顱磁刺激[3]、光刺激[4]等。低強度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound， LIPUS)為安全、非侵入性的超聲治療方法，臨床廣泛用于骨折后康復治療[5-6]。近來研究發現LIPUS可觸發完整腦回路中的神經元活動及動作電位[7]，對血管性損傷[8]及鋁超載[9]所致腦損傷具有一定保護作用，由此推測對PD亦可能產生作用。本研究以1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium， MPP+)誘導小鼠神經母細胞瘤Neuro-2a(N2a)細胞株建立PD細胞模型，觀察LIPUS是否對 MPP+誘導神經細胞損傷具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 N2a細胞株(認知發育與學習記憶障礙轉化醫學重慶市重點實驗室贈與)；DMEM高糖培養基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridiniumion，MPP+)、2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA，Sigma公司)；青霉素-鏈霉素溶液、線粒體膜電位試劑盒(JC-1)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒；CCK8試劑；總RNA提取試劑盒、Real Master Mix；逆轉錄試劑盒。超聲基因轉染儀(重慶醫科大學超聲影像學研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 在含10% FBS及1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM完全培養液中，于37℃、5%二氧化碳濃度恒溫培養箱中培養N2a細胞，每2天傳代1次。取對數生長期N2a細胞，調整細胞濃度后，根據實驗需要接種于96孔板或24孔板內。以不同濃度(0.25、0.5、0.75、1.0和1.5 mmol/L)MPP+作用于N2a細胞24 h后檢測細胞存活率，并選擇適當MPP+濃度建立PD細胞模型。

將細胞分為對照組、超聲對照(LIPUS)組、MPP+組及超聲處理(MPP++LIPUS)組。對MPP+組及MPP++LIPUS組加入MPP+(終濃度為0.75 mmol/L),對照組和LIPUS組加入等體積不含血清的DMEM培養基，4 h后對LIPUS組和MPP++LIPUS組進行LIPUS處理(1 MHz，50 mW/cm2，脈沖重復頻率為1 kHz，輻照10 min)。加藥24 h后檢測4組各項指標。

1.2.2 CCK8法檢測細胞存活率 每孔加入一定體積CCK8溶液(終濃度為10%)，于培養箱中繼續培養0.5～1 h后，用酶標儀在450 nm波長處測定各組各孔吸光度(optical density, OD)值，以空白孔數值進行矯正，計算細胞存活率。

1.2.3 JC-1法檢測線粒體膜電位 消化收集各組細胞，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，按照試劑盒操作說明進行JC-1染色。采用熒光顯微鏡及酶標儀分別在激發波長為490 nm，發射波長為530 nm及激發波長為525 nm，發射波長為590 nm進行檢測。

1.2.4 DCFH-DA法檢測細胞內活性氧 消化收集各組細胞，以1 000 r/min 離心5 min，棄上清，裝載DCFH-DA探針(10 μmol/L)，37℃孵育30 min后PBS洗滌2次。使用熒光顯微鏡及酶標儀在激發波長為488 nm，發射波長為525 nm進行檢測。

1.2.5 AnnexinV-FITC/PI法檢測細胞凋亡 消化收集各組細胞，以1 000 r/min 離心5 min，棄上清，按照試劑盒操作說明進行AnnexinV-FITC/PI染色，使用流式細胞儀進行檢測。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測瞬時受體電位M7(transient receptor potential melastatin 7, TRPM7)的mRNA表達水平 取ddH2O 4.5 μl、2.5×Real Master Mix 7.5 μl、cDNA 2 μl及引物1 μl，共15 μl體系，用Bio-Rad CFX Manager儀器進行檢測，以 2-ΔΔCt方法計算所得數據。

1.3 統計學分析 采用Graphpad prism 7統計分析軟件。計量資料以±s表示。 組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度MPP+對N2a細胞存活率的影響 以不同濃度(0.25、0.5、0.75、1.0和1.5 mmol/L)MPP+作用于N2a細胞24 h后，與對照組相比，各組細胞存活率呈濃度依賴性下降(P均<0.01)，即MPP+毒性隨濃度增加而增高，見表1。本研究選擇0.75 mmol/L 的MPP+濃度建立PD細胞模型，并進行后續實驗。

表1 不同濃度MPP+作用24 h對N2a細胞存活率的影響 (±s，n=5)

表1 不同濃度MPP+作用24 h對N2a細胞存活率的影響 (±s，n=5)

MPP+濃度(mmol/L)細胞存活率(%)0(對照組)1000.2589.14±2.62?0.576.66±1.86?0.7568.44±4.12?1.058.22±3.06?1.543.90±1.57?F值284.70P值<0.01

注：*：與對照組比較，P<0.01

2.2 LIPUS對MPP+誘導N2a細胞存活率的影響 MPP+組N2a細胞存活率較對照組顯著下降(P<0.01)，而MPP++LIPUS組較MPP+組存活率有所上升(P<0.01)，單獨LIPUS組對N2a細胞未產生明顯細胞毒性(P>0.05)，見表2。

2.3 LIPUS對MPP+誘導N2a細胞線粒體膜電位的影響 與對照組相比，MPP+組紅色熒光明顯減少，綠色熒光明顯增多，而MPP++LIPUS組比MPP+組紅色熒光增加、綠色熒光減少(圖1)。以酶標儀檢測紅綠熒光強度比值來反應線粒體膜電位的變化，與對照組相比，MPP+組熒光比值明顯下降，而MPP++LIPUS組相比MPP+組熒光比值上增多(P均<0.01，表2)。

表2 LIPUS對MPP+誘導的細胞毒性及TRPM7表達的影響(±s，n=3)

表2 LIPUS對MPP+誘導的細胞毒性及TRPM7表達的影響(±s，n=3)

組別細胞毒性細胞存活率(%)ROS水平(%)線粒體膜電位(%)(紅綠熒光強度比值)細胞凋亡率(%)TRPM7表達LIPUS組102.10±2.74△104.82±5.95△99.12±1.41△7.12±0.66△1.18±0.05△MPP+組71.08±4.74?219.59±12.50?70.46±1.35?22.96±3.86?0.45±0.03?MPP++LIPUS組90.72±2.46#163.92±5.64#87.10±2.94#14.25±2.12#1.41±0.12#對照組1001001006.80±0.951.00±0.06F值44.6390.74114.733.4787.97P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注：*：與對照組比較，P<0.01；#：與MPP+組比較，P<0.01；△：與對照組比較，P>0.05

圖1 熒光顯微鏡觀察各組JC-1染色結果

2.4 LIPUS對MPP+誘導的N2a細胞內ROS水平的影響 對照組及LIPUS組未觀察到明顯的綠色熒光，MPP+組細胞的綠色熒光較對照組明顯增加，MPP++LIPUS組則較MPP+組有所降低(圖2)。酶標儀定量分析結果顯示，與對照組相比，MPP+組細胞內ROS水平顯著升高(P<0.01)，MPP++LIPUS組則較MPP+組細胞內ROS水平有所降低(P<0.01)。與對照組相比，LIPUS組ROS水平無明顯變化(P>0.05)，見表2。

2.5 LIPUS對MPP+誘導N2a細胞凋亡的影響 照組相比，MPP+組N2a細胞凋亡率明顯上升(P<0.01)，而MPP++LIPUS組細胞凋亡率較MPP+組下降(P<0.01)，且對照組與LIPUS組細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3、表2。

2.6 LIPUS對MPP+誘導N2a細胞中TRPM7表達的影響 與對照組相比，MPP+組N2a細胞中TRPM7的mRNA表達水平降低，而MPP++LIPUS組TRPM7的mRNA表達水平較MPP+組顯著上升(P均<0.01)，見表2。

3 討論

長久以來，藥物一直是治療PD的傳統手段，但其作用有限，且存在不同程度不良反應。超聲在神經科學領域顯示出了良好應用前景[10]。采用MR引導下聚焦超聲技術行丘腦或蒼白球切開術，可改善PD患者的震顫及運動障礙[11-12]，但以高強度聚焦超聲進行組織消融帶來各種臨床挑戰，如手術定位的準確性、手術區域的溫度控制及重復治療的安全性等。近來研究[13-15]顯示超聲可對刺激區域的神經電活動及相關生物化學反應發揮調控作用。本研究探討以低強度(50 m/cm2)LIPUS治療PD的可能性，體外單獨作用下并未觀察到明顯細胞毒性，提示LIPUS具有較好的安全性。

基于各種神經毒素誘導建立多巴胺能神經元損傷模型是進行PD相關研究的重要手段,由MPTP及其活性產物MPP+介導的PD體內外模型體系是常用方法之一[16-17]。N2a細胞為小鼠來源的神經母細胞瘤細胞，是可用于建立PD細胞模型的多巴胺神經元[18-19]。本研究通過MPP+損傷N2a細胞建立PD體外模型，探討LIPUS對多巴胺神經元的作用。MPP+可選擇性蓄積于多巴胺能神經元的線粒體內，導致呼吸鏈的電子傳遞效率下降，損傷線粒體功能，使其產生過多ROS而引發氧化應激[20-21]；持續氧化應激狀態又會進一步加重線粒體功能障礙，二者互為因果且相互影響，最終引發線粒體途徑的細胞凋亡[22]。線粒體膜電位穩定是維持線粒體功能正常的先決條件，膜電位降低導致線粒體功能障礙是細胞早期凋亡的一個重要特征[23]。本研究中LIPUS能減緩MPP+引起的線粒體膜電位去極化及ROS累積，并抑制細胞凋亡，原因可能是LIPUS可恢復線粒體膜電位，以保證線粒體功能正常并改善MPP+引起的細胞氧化應激狀態，從而抑制細胞凋亡，對多巴胺能神經元發揮保護作用。

圖2 熒光顯微鏡觀察各組DCFH-DA染色結果

圖3 流式細胞術檢測結果

TRPM7是瞬時電位受體通道家族的一員，不僅對機械敏感，也對多巴胺能神經元的分化及存活具有重要意義，其功能異常或表達下調可引起多巴胺神經元丟失[24-25]。同時，TRPM7還是一種重要的Mg2+轉運體，而Mg2+具有神經調控及抗氧化作用[26-27]。通過補充Mg2+上調TRPM7表達，可抑制神經毒素對多巴胺能神經元的損傷[28]。本研究發現LIPUS處理后可恢復TRPM7表達，提示TRPM7可能參與LIPUS對多巴胺能神經元的保護作用，其機制可能是LIPUS在上調TRPM7表達的同時提高了Mg2+的轉運效率，Mg2+與TRPM7協同抑制MPP+的毒性，尚需進一步觀察。

本研究發現以50 mW/cm2功率超聲處理能緩解MPP+所致N2a細胞損傷，可在一定程度上減輕MPP+的神經毒性作用，提示通過超聲的神經調控作用治療PD或可成為一種潛在策略，其機制有待進一步探討。