P38 MAPK信號通路在漆樹酸改善苯腎上腺素誘導的小鼠心肌細胞肥大中的作用*

彭波輝， 彭 昌△， 黃麗欣， 羅孝美， 韓 笑

(遵義醫科大學 1附屬醫院兒內科， 2基礎醫學院生理教研室， 貴州 遵義 563000)

心肌肥厚在多種心血管疾病發生、發展過程中扮演了不可或缺的角色，是目前公認會導致心力衰竭和心源性猝死的獨立危險因素[1]。近年來心肌肥厚的發病率呈持續上升的趨勢，而目前針對該病的預防及治療措施均不完善[2]，因此，尋找更合適的防治措施成為當前的研究熱點。研究證實，心肌肥厚是由多條信號通路被激活誘導的，而其中備受關注的是P38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)信號通路[3]。P38 MAPK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶信號轉導通路中重要組成成員之一，可調節心肌細胞肥大、凋亡和炎癥等反應[4]。證據表明，P38 MAPK信號通路在心肌細胞肥大啟動與心肌細胞肥大病理生理過程中起著重要的作用[5-6]。本課題組前期研究已經證實組蛋白乙?；敢种苿┢針渌?anacardic acid, AA)能夠通過下調組蛋白乙酰化水平從而改善苯腎上腺素(phenylephrine, PE)誘導的小鼠心肌肥厚，但參與調控該作用的上游信號通路仍不清楚[7]。P38 MAPK信號通路是否直接參與了漆樹酸改善心肌肥厚的作用國內外尚未見報道。因此，本研究通過體外苯腎上腺素誘導小鼠心肌細胞肥大模型，觀察漆樹酸對小鼠心肌細胞肥大的抑制作用，并探討P38 MAPK信號通路在該病理生理過程中可能發揮的作用。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

選取SPF級新生1～3 d健康昆明乳鼠120只，體重2.3～2.7 g，雌雄不限，由重慶醫科大學動物中心提供，動物許可證號為SYXK(渝) 2012-0015。

2 主要試劑與儀器

P38 抑制劑SB203580(Calbiochem);膠原酶Ⅱ、苯腎上腺素及4, 6-聯脒-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)均購自Sigma;胎牛血清(Gibco);抗P38及p-P38單克隆抗體(Cell Signaling Technology);抗第9位賴氨酸乙?；慕M蛋白H3(acetylated histone H3 at lysine 9, H3K9ac)和心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)單克隆抗體及兔 lgG多克隆抗體 (Abcam)；抗Alexa Fluor 488熒光標記山羊抗小鼠IgG 熒光Ⅱ抗(中杉金橋生物技術有限公司);抗α-actin及HRP 標記Ⅱ抗(Proteintech);TRIzol 總RNA提取試劑盒(BioTeke);SDS-PAGE凝膠試劑盒(Beyotime);熒光定量PCR試劑盒及逆轉錄試劑盒(TaKaRa);免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)試劑盒(Beaver)。熒光定量PCR儀(Bio-Rad)。

3 主要實驗方法

3.1心肌細胞原代培養 選取新生1～3 d昆明乳鼠，在超凈工作臺上常規手術取出心室肌組織，預冷PBS液洗凈殘血，眼科剪將其剪成1～3 mm3大小的組織塊，0.05%膠原酶Ⅱ反復吹打消化2 min，沉淀后吸取上清液，重復直至組織塊被消化完全。將收集的上清液240×g離心10 min，棄上清，將沉淀與4 mL含20%胎牛血清DMEM培養液重懸后接種到25 mL培養瓶中，37 ℃、5% CO2培養箱中差速培養90 min后，將細胞懸液轉移至新的培養瓶中，加入終濃度為0.1 mmol/L BrdU繼續放入培養箱中培養。

3.2實驗分組及細胞干預 各組藥物濃度參照文獻[8-10]，培養心肌細胞48 h后，按隨機數字表法將心肌細胞分為6組：空白對照(control)組，給予等量生理鹽水處理；溶劑對照(PE+DMSO)組，用100 μmol/L PE加等體積的DMSO作用于心肌細胞；PE組，用100 μmol/L PE作用于心肌細胞；PE+AA組，用50 μmol/L AA孵育心肌細胞 30 min 后，再加入 100 μmol/L PE; PE+AA+P38抑制劑SB203580(PE+AA+SB)組，用50 μmol/L AA和20 μmol/L SB203580同時孵育心肌細胞 30 min后，再加入100 μmol/L PE；PE+SB組，用20 μmol/L SB203580孵育心肌細胞 30 min后，再加入100 μmol/L PE。

3.3Western blot檢測 心肌細胞干預48 h后，提取各組心肌細胞漿蛋白和核蛋白，用BCA法進行蛋白定量分析。12% SDS-PAGE分離蛋白，半干轉轉至PVDF膜后，5% BSA封閉 2 h，分別加入兔來源單克隆抗體P38(1∶1 000)、p-P38 (1∶2 000)、H3K9ac (1∶5 000)和ANP(1∶5 000)，4 ℃ 搖床孵育過夜，TBST 洗滌 6次，每次 5 min，然后加入 HRP標記的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶2 000) 搖床上孵育 1 h，TBST洗滌 6 次，每次 5 min，化學發光試劑發光顯影。采用Bio-Rad圖像分析儀進行圖像掃描；應用Quantity One 4.4軟件進行分析。

3.4RT-qPCR 檢測 針對肌細胞增強因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)基因CDS核心編碼區設計特異性引物，引物用Primer Premier 5.0軟件設計，由寶生物公司合成。將MEF2C基因產物進行梯度稀釋，運用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀擴增，做出標準曲線，得到R2值和擴增效率。MEF2C的上游引物序列為5′-CCTTTTCCTTTTCTGGGGACTTGTT-3′，下游引物序列為5′-TGCCGCTGTGAGCCTCTATTTG-3′，產物大小為176 bp;β-actin的上游引物序列為5′-CCTTTATCGGTATGGAGTCTGCG-3′，下游引物序列為5′-CCTGACATGACGTTGTTGGCA-3′，產物大小為289 bp。反應條件為：94 ℃ 30 s; 94 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s,共40個循環。以β-actin作為內參照，所得數據用PCR儀自帶的基于Pfaffl原理的相對定量數據分析軟件處理。

3.5免疫共沉淀 移去培養液，用結合緩沖液(含蛋白酶抑制劑)裂解細胞，混勻后置于冰上孵育10 min，4 ℃、20 000×g離心10 min，收集上清。將磁珠預處理后，分別加入p-P38抗體和H3K9ac抗體，室溫翻轉15 min，結合緩沖液洗滌3次，加入細胞裂解液4 ℃翻轉孵育過夜。結合緩沖液洗滌3次?？乖疵摚杭尤?×SDS-PAGE Loading Buffer混合均勻，95 ℃加熱 5 min，室溫下18 000×g離心10 min，收集上清液進行Western blot檢測。

3.6免疫熒光檢測 制作細胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌，0.3% Triton X-100室溫孵育20 min，PBS洗滌，山羊血清室溫封閉30 min，抗α-actin(1∶50)4 ℃孵育過夜，PBS洗滌，Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠IgG Ⅱ抗(1∶1 000)，室溫避光孵育1.5 h，PBS洗滌，DAPI染核5 min，PBS洗滌，封片劑封片，于熒光倒置顯微鏡下觀察，應用Image-Pro Plus專業圖像分析軟件測定細胞表面積。

4 統計學處理

所有數據用均數±標準差(mean±SD)表示，采用 SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間均數比較應用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組小鼠心肌細胞中P38磷酸化水平

Western blot實驗結果顯示,在小鼠心肌細胞中，總P38的表達水平無明顯變化，而p-P38的水平在苯腎上腺素組顯著高于空白對照組(P<0.05)；P38 抑制劑處理組和漆樹酸干預組P38的磷酸化水平則顯著低于苯腎上腺素組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The expression of P38 and p-P38 in the mouse myocardial cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPE group.

圖1 小鼠心肌細胞中P38和p-P38的表達水平

2 各組小鼠心肌細胞中 H3K9ac水平

Western blot實驗結果顯示,在小鼠心肌細胞中，H3K9ac的水平在苯腎上腺素組顯著高于空白對照組(P<0.05)；而P38 抑制劑處理組和漆樹酸干預組H3K9ac水平則顯著低于苯腎上腺素組(P<0.05)，見圖 2。

3 p-P38與H3K9ac之間的相互調控作用

免疫共沉淀結果顯示,p-P38可特異性地將H3K9ac共沉淀下來，見圖3。

Figure 2. The level of H3K9ac in the mouse myocardial cells with different treatments. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPE group.

圖2 小鼠心肌細胞組蛋白H3K9ac水平的比較

4 P38抑制劑和漆樹酸下調苯腎上腺素誘導的心臟發育相關基因的表達

RT-qPCR結果顯示，苯腎上腺素組心臟核心轉錄因子MEF2C的mRNA水平及心肌肥厚標志物ANP的蛋白水平均顯著高于空白對照組(P<0.05)；而P38 抑制劑干預組和漆樹酸干預組MEF2C和ANP表達水平則顯著低于苯腎上腺素組(P<0.05)，見圖4。

5 P38抑制劑和漆樹酸改善苯腎上腺素誘導的小鼠心肌細胞肥大

免疫熒光結果表明，與空白對照組比較，苯腎上腺素組小鼠心肌細胞表面積明顯增大(P<0.05)；與苯腎上腺素組相比，P38 MAPK抑制劑組和漆樹酸組心肌細胞表面積均明顯著縮小(P<0.05)，見圖5。

討 論

心肌肥厚是多種心血管疾病共同的病理生理過程，是由多種因素刺激心肌細胞產生的病理反應，主要表現為心肌細胞體積增大，蛋白合成增多[11]。早期階段表現為一種適應性反應，如果治療不當這種適應過程由于失代償可能逐漸發展為心力衰竭和心源性猝死,因此，尋找更為有效的治療措施具有重要的意義。研究表明，苯腎上腺素作為一種重要的神經體液因素在心肌肥厚的病理發病過程中發揮重要作用[12]。心肌細胞內的一系列信號轉導通路在各種心血管疾病中扮演了重要角色。而在心肌肥厚中備受關注的是MAPKs信號轉導通路。MAPKs信號通路是真核細胞的一個重要信號系統，能將多種細胞外刺激信號從細胞膜傳遞至細胞核內，從而參與調節細胞分化、增殖和肥大[13]。P38 MAPK信號通路是MAPKs家族中重要成員之一。P38磷酸化可刺激心臟核心轉錄因子MEF2C表達增加及下游肥大基因ANP表達上調，從而促進心肌細胞肥大，P38信號通路抑制劑SB203580可以阻斷該通路[14]。本課題組前期已經證明漆樹酸能改善苯腎上腺素誘導的心肌肥厚[7]。在本研究中我們用苯腎上腺素誘導體外培養原代心肌細胞，探討P38 MAPK信號通路是否參與了漆樹酸改善苯腎上腺素誘導的心肌細胞肥大。

Figure 3. Co-immunoprecipitation (CoIP) in cell lysates of mouse myocardial cells exposed to six different experimental conditions with anti-p-P38-protein G magnetic beads and immunoblot (IB) with an anti-H3K9ac or anti-p-P38 antibody for evaluation of protein expression. Input: positive control; IgG: negative control.

圖3 Co-IP檢測p-P38和H3K9ac在小鼠心肌細胞中的相互調控作用

已有研究證實，在血管緊張素Ⅱ所致大鼠心肌細胞肥大模型中，給予P38 信號通路抑制劑SB203580可有效抑制心肌肥大標志物腦尿鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)的表達水平，從而使心肌肥厚癥狀得到改善[15]。本研究結果證實在苯腎上腺素誘導的小鼠心肌細胞肥大模型中，苯腎上腺素組P38磷酸化水平是顯著升高，而P38抑制劑和漆樹酸能明顯抑制P38磷酸化的表達水平。同時也觀察到在苯腎上腺素誘導小鼠心肌細胞肥大過程中H3K9乙?；揭诧@著升高，而P38抑制劑和漆樹

Figure 4. The expression of MEF2C and ANP in the mouse myocardial cells. A: the mRNA levels of MEF2C; B: the protein levels of ANP. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPE group.

圖4 小鼠心肌細胞MEF2C mRNA和ANP蛋白的表達水平

酸能明顯抑制H3K9乙?；剑亿厔菖cp-P38水平相一致。因此，我們推測p-P38與H3K9ac相互調控參與漆樹酸改善苯腎上腺素誘導的心肌細胞肥大。為了進一步驗證，我們應用免疫共沉淀檢測二者之間的調控關系，結果表明p-P38與H3K9ac之間可能存在相互作用。本實驗結果也顯示，苯腎上腺素處理小鼠心肌細胞中MEF2C mRNA 表達水平顯著升高的，而P38抑制劑和漆樹酸能明顯抑制MEF2C mRNA表達水平，且變化水平與P38磷酸化水平相一致。上游心肌肥厚相關轉錄因子轉錄水平變化不同于下游心肌肥厚相關基因的變化。因此我們進一步檢測了心肌肥厚標志物ANP的蛋白表達水平，結果表明ANP的蛋白表達水平在苯腎上腺素誘

Figure 5. Mouse myocardial cell stained with immunofluorescence and statistical diagram of myocardial cell surface area. A: control group; B: PE+DMSO group; C: PE group; D: PE+AA group; E: PE+AA+SB group; F: PE+SB group. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPE group.

圖5 小鼠心肌細胞免疫熒光染色及心肌細胞表面積比較

導小鼠心肌細胞肥大中也顯著升高，而P38抑制劑和漆樹酸亦能明顯抑制ANP蛋白的表達。免疫熒光結果表明，苯腎上腺素能使心肌細胞表面積明顯增大，而P38抑制劑和漆樹酸能明顯減小心肌細胞表面積。以上結果均提示P38 MAPK信號通路可能參與了漆樹酸改善苯腎上腺素誘導的心肌細胞肥大。本研究進一步揭示漆樹酸改善心肌肥厚的具體上游信號調控機制，為肥厚型心肌病的防治提供了參考資料。但是，MAPKs家族中其他通路是否參與該病理生理過程仍不是十分清楚，尚待深入研究。