冠心病患者來源HDL對小鼠腹腔巨噬細胞脂質沉積及凋亡的影響*

王 遠， 高宏偉， 馮高潔， 代 佩， 張秦風， 白 瑞， 秦衛偉， 李 虹， 高 奮

(山西醫科大學第二臨床醫學院， 山西 太原 030001)

脂蛋白代謝異常是動脈粥樣硬化的重要危險因素。低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平與冠心病發病呈正相關，而高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)通過膽固醇逆轉運、抗凋亡和抗炎等機制發揮抗動脈粥樣硬化作用[1]。然而多個臨床研究(ILLUMINATE、dal-OUTCOMES、AIM-HIGH和HPS2-THRIVE)卻表明應用膽固醇酯轉運蛋白抑制劑雖然可顯著升高HDL水平，但心血管事件和死亡風險非但沒有下降，反而明顯增加[2]，提示單純升高HDL水平并不能發揮HDL的抗動脈硬化效應。HDL是由載脂蛋白與脂質組成的大顆粒分子，功能上具有高度的異質性。已有研究證實，在糖尿病[3]、代謝綜合征、感染[4]、系統性紅斑狼瘡以及類風濕性關節炎[5]等炎癥性疾病時，功能正常的HDL向“失功能HDL”轉變，其抗動脈粥樣硬化能力下降并具有促動脈硬化作用[6-7]。然而，在冠心病條件下，HDL的功能改變如何，尚缺乏文獻報道。本研究將通過提取健康(healthy)人群、穩定型冠心病(stable coronary artery disease, SCAD)和急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI) 3類人群的HDL，體外觀察不同人群HDL對巨噬細胞脂質沉積、膽固醇轉運蛋白表達及細胞凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 人群資料

選擇2018年1月～2018年6月山西醫科大學第二醫院心內科住院患者200例，其中男性112例，女性88例，年齡48～72歲，根據冠脈造影結果分為冠脈正常對照組65例、穩定型冠心病組68例和急性心肌梗死組67例。記錄各組一般資料并進行生化檢驗，包括性別、年齡、體重、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、吸煙史、空腹血糖(fasting glucose，FG)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein chesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein chesterol, HDL-C)。所有患者均簽署知情同意書，如未取得知情同意，退出本研究。本研究獲得山西醫科大學第二附屬醫院倫理委員會的批準，整個實驗階段嚴格執行醫學倫理委員會規章制度。入選患者均排除內分泌疾病、嚴重肝腎功能異常、嚴重感染、重度貧血、心臟瓣膜病和腫瘤等疾病。

穩定型冠心病的診斷依據2007版《慢性穩定型心絞痛診斷及治療指南》，慢性穩定型心絞痛指心絞痛發作的程度、頻率、性質及誘發因素在數周內無顯著變化的患者，通常見于冠狀動脈至少一支主要分支管腔直徑狹窄在50%以上，當體力或精神應激時，冠狀動脈血流不能滿足心肌代謝的需要，導致心肌缺血，而引起的心絞痛發作，休息或含服硝酸甘油可緩解的患者。

急性心肌梗死的診斷依據2012年ESC《第3版心肌梗死全球定義》，AMI的診斷標準為檢測到心臟生物標志物心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)上升和(或)下降超過健康人群參考值上限(upper reference limit，URL)第99百分位，且符合下列條件中的至少1項：(1)有缺血癥狀；(2)新出現或很可能新出現ST段顯著抬高或T波改變，或新出現左束支傳導阻滯；(3)心電圖出現病理性Q波；(4)有新出現的存活心肌損失或新出現局部室壁運動異常的影像學證據；(5)血管造影或尸檢發現冠狀動脈內血栓。入選患者除滿足上述條件外，均滿足發病24 h內，行急診冠狀動脈造影檢查并證實存在單支或多支血管急性閉塞或伴急性血栓形成。

健康對照組無典型缺血性胸痛，心電圖大致正常，經冠狀動脈造影證實冠狀動脈無斑塊及狹窄。

2 實驗動物

6～8周齡雄性C57/BL6J小鼠，18～20 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供，許可證號為SXXK (晉) 2015-0001。

3 主要試劑

氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)購自上海昂羽生物技術有限公司；巰基乙酸鈉(BD)；抗ATP結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)、ATP結合盒轉運蛋白G1(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)、Bax和Bcl-2抗體均購自于Abcam；抗GAPDH抗體(BioWorld);抗β-actin抗體、goat anti-mouse IgG、goat anti-rabbit IgG、RPMI-1640培養基、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏化學發光試劑和RIPA裂解緩沖液(博士德生物科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液和飽和油紅O染色液(Solarbio)；活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)測試盒(南京建成生物工程研究所)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒(Beyotime)；ACK紅細胞裂解液(北京諾博萊德科技有限公司)。

4 主要方法

4.1HDL的提取及鑒定 利用溴化鉀(KBr)將收集好的新鮮血漿密度調整為1.24×103g/L， 加入含密度為1.063×103g/L的KBr溶液的離心管底部，配平后，65 000 r/min離心320 min。血漿經超速離心后大致分3層：最上層為TG、極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein, VLDL)和LDL，中間層為HDL，底層為無脂血漿。采用腰穿針將中層HDL吸出后，通過PD-10脫鹽柱透析。透析后的HDL冷凍成固態后置入冷凍離心干燥機凍干，約12 h后可形成HDL粉末。HDL粉末溶于去離子水后采用BCA法測定蛋白濃度，本研究中1.5 mL血漿提出的HDL粉末溶于250 μL去離子水后所測的蛋白濃度約為2 g/L。采用SDS-PAGE法鑒定HDL純度。

4.2小鼠腹腔巨噬細胞的提取、培養及鑒定 將巰基乙酸鈉與去離子水配制成2%巰基乙酸鈉溶液，121℃滅菌，4 ℃保存備用。8周齡C57/BL6J小鼠予腹腔注射2 mL 2%巰基乙酸鈉溶液，刺激72 h。頸椎脫臼處死，乙醇浸泡3 min，剪開皮膚，充分暴露腹膜，腹腔內注射10 mL預冷PBS，輕柔5 min，用注射器抽取腹腔灌洗液至15 mL離心管中，800 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL ACK裂解液裂解3～5 min。離心后20% FBS RPMI-1640培養基重懸細胞，置于37 ℃孵箱內，4 h后PBS沖洗未貼壁細胞，貼壁細胞為純度較高的原代巨噬細胞。采用F4/80抗體進行標記，熒光顯微鏡鑒定巨噬細胞純度。

4.3實驗分組及干預 提取的巨噬細胞按每孔1×106個接種于6孔板內，實驗分組如下：(1)對照(control)組：無干預措施；(2)ox-LDL組：50 mg/L ox-LDL干預24 h；(3)ox-LDL+HDLhealthy組：50 mg/L ox-LDL及50 mg/L HDLhealthy聯合培養24 h；(4)ox-LDL+HDLSCAD組：50 mg/L ox-LDL及50 mg/L HDLSCAD聯合培養24 h；(5)ox-LDL+HDLAMI組：50 mg/L ox-LDL及50 mg/L HDLAMI聯合培養24 h。

4.4巨噬細胞油紅O染色 飽和油紅O原液與去離子水按3∶2體積比配制油紅O工作液，混勻，室溫放置5～10 min，過濾后備用。染色步驟：(1)吸棄各實驗組培養液，PBS漂洗3次；(2)4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水浸洗后60%異丙醇浸洗1 min；(3)油紅O工作液染色30 min；(4)60%異丙醇漂洗20 s；(5)蒸餾水洗；(6)甘油明膠封片；(7)倒置顯微鏡觀察脂質染色結果，采集圖像。

4.5Western blot實驗 提取各組細胞總蛋白，以BCA試劑盒測蛋白濃度。取100 μg樣品蛋白于沸水1 min變性，取20 μg蛋白樣本用SDS-PAGE分離，電泳完畢后半干轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST封閉2 h，分別加入稀釋好的 I 抗(抗β-actin、ABCA1、ABCG1、Bax和Bcl-2抗體，均按1∶1 000稀釋)，4 ℃搖床低速過夜。TBST充分洗滌后加入相應稀釋 II 抗室溫輕搖2 h，TBST再次充分洗滌。ECL法顯影，分析條帶灰度值，以β-actin為參照，用待測蛋白灰度值與內參的比值來表示蛋白表達水平。

4.6巨噬細胞內ROS含量的測定 采用ROS測試盒各組細胞ROS的含量。DCFH-DA原液與PBS按1 ∶1 000配制成工作液。干預結束時，吸棄培養液，用PBS漂洗3次，各取1 mL 工作液加入各實驗組，37 ℃，避光孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察細胞內ROS的含量，采集圖像。

4.7巨噬細胞凋亡率的檢測 用annexin V/PI法檢測巨噬細胞凋亡率，操作按試劑盒說明進行。

5 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計處理及分析，計量數據以均數±標準差(mean±SD)表示。人群資料數據分析前均進行正態性及方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同人群臨床數據的比較

入選穩定型冠心病患者68例、急性心肌梗死67例及年齡、性別匹配的冠狀動脈造影正常者65例。各組間體重指數(body mass index，BMI)、SBP、DBP、FG和TG水平的差異無統計學顯著性；與對照組比較，SCAD組及AMI組LDL-C和HDL-C的差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同人群臨床資料比較

BMI: body mass index; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; FG: fasting glucose; TG: triglyceride; LDL-C: low-density lipoprotein chesterol; HDL-C: high-density lipoprotein chesterol; SCAD: stable coronary artery disease; AMI: acute myocardium infarction.

2 血漿HDL的分離及鑒定

血漿經超速離心后大致分3層：最上層為TG、VLDL和LDL，中間層為HDL，底層為無脂血漿，見圖1A。采用SDS-PAGE鑒定HDL純度，由于HDL中主要成分為ApoA-I，在30 kD處可見蛋白富集，與血漿樣本比較，白蛋白(分子量約72 kD)被大量去除，見圖1B。

Figure 1. Isolation and identification of HDL from different subjects. A: different fractions of plasma after sequential ultracentrifugation; B: SDS-PAGE of HDL and plasma. Lane 1: HDL from healthy subjects; Lane 2: HDL from patients with stable coronary artery disease; Lane 3: HDL from patients with acute myocardium infarction.

圖1 不同人群HDL的提取及鑒定結果

3 小鼠腹腔來源巨噬細胞鑒定

光鏡下巨噬細胞呈圓形、橢圓形、三角形或不規則形，有偽足和突起。熒光顯微鏡下巨噬細胞特異性標志F4/80呈紅色熒光，DAPI染核，可確定巨噬細胞純度達95%以上，見圖2。

Figure 2. Identification of mouse peritoneal macrophages by F4/80 (×40).

圖2 小鼠腹腔來源巨噬細胞的鑒定結果

4 油紅O染色觀察細胞內脂滴含量

與對照組相比，經ox-LDL單獨或聯合HDL處理后巨噬細胞內脂質沉積明顯增加(P<0.05)；與ox-LDL單獨處理相比，聯合HDLhealthy處理后巨噬細胞內脂質沉積減少，而聯合HDLSCAD或HDLAMI處理后巨噬細胞內脂質沉積增加(P<0.05)；與HDLSCAD組相比，HDLAMI組巨噬細胞內脂質沉積進一步增加(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. Intracellular lipid deposition in mouse peritoneal macrophages. The levels of intracellular lipids were determined by oil red O staining (×200). A: control group； B：ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D: ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

圖3 用油紅O染色法測定小鼠腹腔巨噬細胞內脂質沉積

5 不同來源HDL對泡沫細胞內ROS表達的影響

與對照組相比，經ox-LDL單獨或聯合HDL處理后巨噬細胞內ROS的含量明顯增加；與ox-LDL單獨處理相比，聯合HDLhealthy處理后巨噬細胞內ROS的生成減少，而聯合HDLSCAD或HDLAMI處理后巨噬細胞內ROS的水平反而增加(P<0.05)；與HDLSCAD組相比，HDLAMI組巨噬細胞內ROS的水平進一步增加(P<0.05)，見圖4。

6 不同來源HDL對泡沫細胞ABCA1和ABCG1表達的影響

與對照組相比，經ox-LDL單獨處理或聯合HDL處理后巨噬細胞內ABCA1和ABCG1的表達上調(P<0.05)；與單純ox-LDL處理組相比，HDLhealthy處理后巨噬細胞內ABCA1和ABCG1的表達進一步增加(P<0.05)，而聯合HDLSCAD或HDLAMI處理后巨噬細胞內ABCA1和ABCG1的表達反而下調(P<0.05)；與HDLSCAD組比較，HDLAMI組ABCA1和ABCG1的表達進一步下調(P<0.05)，見圖5。

7 不同來源HDL對巨噬細胞凋亡的影響

與對照組相比，ox-LDL處理后巨噬細胞凋亡增加；與ox-LDL處理組比較，HDLhealthy可抑制巨噬細胞細胞凋亡，而HDLSCAD或HDLAMI處理后巨噬細胞凋亡反而增加;與HDLSCAD處理組比較，HDLAMI處理組巨噬細胞凋亡率進一步升高(P<0.05)，見圖6。

Figure 4. Intracellular ROS levels were measured by DCF analysis under fluorescence microscope (×200). A: control group; B: ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D: ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

圖4 熒光DCF法測定巨噬細胞內ROS結果

Figure 5. The protein expression of ABCA1 and ABCG1 in the mouse peritoneal macrophages was determined by Western blot. A: control group; B: ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D: ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

圖5 Western blot法檢測小鼠腹腔巨噬細胞ABCA1和ABCG1蛋白的表達

8 不同來源HDL對巨噬細胞Bcl-2和Bax表達的影響

與對照組相比，ox-LDL處理巨噬細胞后Bcl-2表達下調，Bax表達上調(P<0.05)；與單純ox-LDL處理組比較，HDLhealthy處理后Bcl-2表達上調，Bax表達下調(P<0.05)，而經HDLSCAD或HDLAMI處理后Bcl-2表達下調，Bax表達上調(P<0.05)；與HDLSCAD處理組比較，HDLAMI處理后Bcl-2表達下調，Bax表達上調(P<0.05)，見圖7。

討 論

脂代謝異常與動脈粥樣硬化發病密切相關。LDL尤其是ox-LDL是巨噬細胞泡沫化的重要誘導劑。細胞內脂質過度沉積形成氧化固醇，后者可激活核肝X受體α和β上調ABCA1和ABCG1表達[8]。HDL是膽固醇從細胞內流出必不可少的受體。新生的HDL顆粒在ABCA1的介導下從外周細胞攝取游離膽固醇，進而進一步酯化形成球形HDL顆粒(α-HDL)，α-HDL在ABCG1的介導進一步獲取游離膽固醇，將膽固醇從巨噬細胞內移出發揮抗動脈粥樣硬化作用[9]。本研究也發現巨噬細胞吞噬ox-LDL后脂質沉積增加，ABCA1和ABCG1表達上調，而來源于健康人群的HDL(HDLhealthy)可進一步上調ABCA1和ABCG1表達，從而減輕泡沫細胞內脂質沉積。

在慢性炎癥性疾病如糖尿病、代謝綜合征、類風濕關節炎及慢性腎臟疾病時，HDL發生“失功能”改變。“失功能HDL”表現為HDL顆粒成分及結構發生改變[10]。前期我們對337例患者(190例經冠狀動脈造影證實為冠心病，127例冠狀動脈造影正常)的HDL亞組及ApoA-I含量進行分析，證實冠心病患者HDL成熟障礙，大顆粒HDL比例降低，小顆粒HDL比例增加，大顆粒HDL下降水平與ApoA-I水平呈正相關[11]。蛋白組學分析提示失功能HDL顆粒內ApoA-I含量減少，SAA和MPO含量增加[12]。動物實驗也已證明SAA和MPO可抑制膽固醇逆轉運誘導脂質沉積增加[13]，這表明，失功能HDL的成分改變可抑制正常的膽固醇逆轉運功能。本研究中我們進一步發現與HDLhealthy處理相比，來源于冠心病患者的HDL(HDLCAD)反而導致巨噬細胞內脂質沉積增加，并下調ABCA1和ABCG1表達，提示冠心病患者來源的HDL損害了正常的膽固醇逆轉運功能，引起巨噬細胞內脂質沉積，但其分子機制尚不明確。

Figure 6. The apoptotic rate of the macrophages was analyzed by flow cytometry with annexin V/PI staining. A: control group; B: ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D: ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

圖6 Annexin V/PI法檢測巨噬細胞的凋亡

Figure 7. The protein expression of Bcl-2 and Bax in mouse peritoneal macrophages was determined by Western blot. A: control group; B: ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D:ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

圖7 Western blot法檢測小鼠腹腔巨噬細胞Bcl-2和Bax蛋白的表達

HDL的氧化修飾是HDL失功能改變的重要機制。冠心病患者體內氧化修飾高密度脂蛋白(ox-HDL)水平升高，且ox-HDL水平與冠狀動脈狹窄程度呈正相關[14]。而HDL經過氧化修飾后其改善內皮功能和抗內皮凋亡能力減弱[15]，具有促動脈粥樣硬化效應。HDL經氧化修飾后產生抗原特異性表位，同ox-LDL一樣也容易被巨噬細胞吞噬。本研究中我們發現HDLhealthy可抑制泡沫細胞內活性氧生成，而經HDLCAD處理后泡沫細胞內活性氧生成進一步增加，推測與泡沫細胞內脂質沉積密切相關。將HDLCAD尾靜脈注射至ApoE-/-小鼠體內，可誘導斑塊進展加速，并且HDLCAD可促進內皮細胞凋亡相關蛋白tBid的表達增加[16]。我們的研究也發現HDLhealthy可減輕ox-LDL誘導的巨噬細胞凋亡，提示健康人的HDL具有抗凋亡作用，而經HDLCAD處理后巨噬細胞凋亡比例升高，凋亡相關蛋白Bcl-2和bax表達失衡，提示HDLCAD喪失了正常的抗動脈粥樣硬化功能，具有促動脈硬化作用。

本研究中我們首次發現HDLCAD可促進泡沫細胞脂質沉積，并下調ABCA1和ABCG1表達，推測與HDLCAD誘導活性氧生成及促進巨噬細胞凋亡相關。但其詳細分子機制仍需進一步探討，這也為HDL功能恢復研究提供了潛在的治療靶點。