miR-323通過FGF9調控缺氧誘導的心肌H9C2細胞凋亡*

張鄰川， 鄭武揚， 唐文明△

(1廈門大學附屬第一醫院杏林分院心內科， 福建 廈門 361022； 2廈門大學附屬第一醫院心內科， 福建 廈門 361000)

心血管疾病是一種缺血性或出血性疾病，具患病率高、死亡率高和致殘率高的特點。據統計，從1990年～2016年，我國心血管疾病致死人數由251萬增加到397萬，患病人數從4 060萬上升到9 400萬[1]，已成為嚴重威脅人類健康和生命的主要疾病[2]。心肌缺氧是指各種原因引起冠狀動脈血流量降低，致使心肌氧等物質供應不足和代謝產物清除減少為主的病理過程[3]。作為臨床上常見的心血管疾病之一[4]，心肌缺氧損傷會引起心肌細胞凋亡，最終導致心肌壞死[5]。然而，關于缺氧心肌損傷的相關機制尚不明確。微小RNAs(microRNAs，miRNAs，miR)是一種高度保守的非編碼RNA，參與缺氧心肌細胞損傷過程[6]。資料顯示， miR-323在缺氧誘導豬心肌組織中表達上調[7]，miR-323通過靶向BRI3調控缺血/再灌注損傷誘導的神經元細胞死亡[8]，但miR-323對缺氧誘導心肌細胞損傷的影響鮮見報道。因此，本研究構建體外缺氧心肌H9C2細胞損傷模型，觀察miR-323是否通過調控成纖維細胞生長因子9(fibroblast growth factor 9，FGF9)表達來影響缺氧誘導的心肌細胞凋亡，為心肌缺氧的臨床診治提供潛在生物標志物。

材 料 和 方 法

1 細胞、實驗主要試劑和儀器

心肌H9C2細胞購自ATCC。DMEM培養基和胎牛血清購自Gibco；胰酶和RIPA裂解液購自北京索萊寶公司；miR-323、anti-miR-323、miR-con、pcDNA-FGF9和si-FGF9購自廣州銳博生物有限公司；青霉素、鏈霉素和Lipofectamine 2000購自賽默飛世爾有限公司；miRNA提取試劑盒購自Qiagen；逆轉錄試劑盒和qPCR試劑盒購自Applied Biosystems；MTT購自Sigma;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；抗FGF9、β-肌動蛋白(β-actin)、cleaved caspase-3、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p-JNK抗體購自Cellular Signaling Technology；辣根過氧化物酶標記的II 抗和ECL發光檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；螢光素酶報告基因載體購自上海吉瑪生物公司；細胞培養瓶購自上海生工科技有限公司。ABI 7500熒光定量PCR儀購自ABI；離心機購自Eppendorf；酶標儀購自Bio-Rad；FACSCalibur流式細胞儀購自BD。

2 方法

2.1細胞培養與分組 H9C2細胞培養于DMEM培養液，其中包含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，放入37 ℃、5% CO2的培養箱，待細胞融合度大于80%，加入適量胰酶消化，進行接種傳代。將H9C2細胞隨機分為正常對照(normal control，NC)組(常氧培養H9C2細胞)和不同處理時間的缺氧(hypoxia)組(缺氧培養H9C2細胞0 h、12 h、24 h和48 h),其中，37 ℃、5% CO2環境為常氧培養條件，1% O2、94% N2、5% CO2為缺氧培養條件[9]。

2.2細胞轉染 調整H9C2細胞密度為1×108/L，將其接種于6孔板，待細胞生長至70%融合度時，根據Lipofectamine 2000試劑說明書的指示開始轉染。將anti-miR-323、pcDNA-FGF9和si-FGF9以及相應的陰性對照轉染入H9C2細胞，并在缺氧條件下培養48 h備用。

2.3qPCR檢測miR-323的表達 根據miRNA提取試劑盒說明書，提取細胞中的總miRNA，按逆轉錄試劑盒說明書操作，將miRNA合成為cDNA，并以cDNA為模板，用實時定量PCR儀進行擴增反應。條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72℃ 8 min，循環40次；然后檢測擴增曲線和熔解曲線。收集Ct值，以2-ΔΔCt法計算miR-323的相對表達量。

2.4Western blot實驗 使用RIPA裂解液充分裂解各組H9C2細胞提取總蛋白，加緩沖液于沸水變性10 min，進行10%的SDS-PAGE，并轉移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入 I 抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，隨后用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液洗膜3次，每次10 min,加入 II 抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ELC顯色，以β-actin為內參照，進行蛋白灰度分析。

2.5MTT比色法檢測細胞活力 收集各組H9C2細胞，用PBS沖洗3次，棄上清，使用胰酶消化，將細胞以每孔1×104個的密度接種于96孔板，每組設置3個復孔，各孔加入MTT工作液100 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜200 μL，37 ℃搖床孵育10 min，置酶標儀測定各孔細胞在490 nm處的吸光度(A)。細胞相對活力(%)=A實驗組/A對照組×100%。

2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 使用胰酶消化各組H9C2細胞，收集1×108/L細胞，加入500 μL緩沖液懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，加入5 μL PI 混勻，在室溫避光條件下反應15 min，置流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.7靶基因預測及雙螢光素酶報告基因實驗 TargetScan數據庫(http://www.targetscan.org/vert_71/)預測miR-323和FGF9的3’-非翻譯區(3’-untranslated region，3’UTR)部分堿基可形成互補配對。分別構建含有miR-323結合位點的FGF9-3’UTR野生型(FGF9-WT)及FGF9-3’UTR突變型(FGF9-MUT)報告基因載體，并分別轉染miR-323或miR-con，培養48 h后，收集H9C2細胞，參照雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，測定雙螢光素酶活性。

3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件對實驗結果進行統計分析。數據以平均值±標準差(mean±SD)表示。兩組數據的比較用t檢驗，多組間數據比較用單因素方差分析，各組均數間的兩兩比較用SNK-q檢驗，以P<0.05代表差異有統計學意義。

結 果

1 缺氧處理心肌H9C2細胞對miR-323和FGF9表達、細胞活力和細胞凋亡的影響

MTT法檢測缺氧對心肌H9C2細胞活力的影響，與0 h組相比，缺氧處理H9C2細胞12 h、24 h和48 h后，細胞活力顯著下降(P<0.05)，并呈時間依賴性，見圖1A。對細胞凋亡的檢測結果發現，與0 h組相比，缺氧處理H9C2細胞12 h、24 h和48 h后，細胞凋亡率逐漸增加(P<0.05)，并呈時間依賴性，見圖1B。qPCR檢測缺氧對心肌H9C2細胞中miR-323表達的影響，發現缺氧不同時間(12 h、24 h和48 h)較0 h組顯著增加H9C2細胞中miR-323的表達量(P<0.05)，見圖1C。Western blot檢測結果顯示，缺氧不同時間(12 h、24 h和48 h)較0 h組明顯減少FGF9蛋白的表達，提高cleaved caspase-3蛋白的水平(P<0.05)，表現出一定的時間依賴性，見圖1D。

Figure 1. The effects of hypoxic exposure for different time on the viability and apoptosis of H9C2 cells. A: the viability of H9C2 cells exposed to hypoxia for different time detected by MTT assay; B: the apoptosis of the H9C2 cells exposed to hypoxia for different time analyzed by flow cytometry; C: the expression of miR-323 in the H9C2 cells exposed to hypoxia for different time detected by qPCR; D: the protein expression of FGF9 and cleaved caspase-3 in the H9C2 cells exposed to hypoxia for different time determined by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vs0 h group.

圖1 缺氧不同時間對心肌H9C2細胞活力和凋亡的影響

2 下調miR-323表達增強缺氧處理心肌H9C2細胞活力和抑制細胞凋亡

qPCR檢測結果表明，與hypoxia+anti-miR-con組比較，轉染anti-miR-323顯著降低缺氧處理H9C2細胞中miR-323表達量(P<0.05)，說明轉染成功,見圖2A。對細胞活力和凋亡的檢測結果顯示，下調miR-323表達較hypoxia+anti-miR-con組增強缺氧處理的H9C2細胞活力，降低細胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白的水平(P<0.05)，見圖2B～D。

Figure 2. The effects of anti-miR-323 transfection on the viability and apoptosis of H9C2 cells exposed to hypoxia. A: the effects of transfection with anti-miR-323 on the miR-323 expression in H9C2 cells exposed to hypoxia; B: the effects of the anti-miR-323 transfection on the viability of H9C2 cells exposed to hypoxia; C: the effects of anti-miR-323 transfection on the apoptotic rate of H9C2 cells exposed to hypoxia; D: the effects of anti-miR-323 transfection on the protein level of cleaved caspase-3 in H9C2 cells exposed to hypoxia. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vshypoxia+anti-miR-con group.

圖2 轉染anti-miR-323對缺氧處理心肌H9C2 細胞活力和凋亡的影響

3 miR-323靶向調控FGF9的表達

生物信息學信息預測FGF9的3’UTR含有與miR-323互補的核苷酸序列,見圖3A，推測miR-323對FGF9表達具有一定的調控作用。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-323明顯減弱FGF9-WT報告基因的螢光素酶相對活性(P<0.05)，而對FGF9-MUT報告基因的螢光素酶相對活性無明顯影響,見圖3B。轉染miR-323顯著降低FGF9蛋白表達，轉染anti-miR-323顯著提高FGF9蛋白表達(P<0.05)，見圖3C。

4 過表達FGF9促進缺氧處理心肌H9C2細胞的活力和抑制細胞凋亡

與hypoxia+pcDNA組比較，轉染pcDNA-FGF9顯著促進缺氧處理的H9C2細胞中FGF9的表達(P<0.05)，提示pcDNA-FGF9轉染成功，見圖4C。與hypoxia+pcDNA組比較，過表達FGF9大幅提升缺氧處理心肌細胞的存活率，見圖4A，減少細胞凋亡率,見圖4B，降低cleaved caspase-3蛋白表達的水平(P<0.05)，見圖4C。

5 下調FGF9表達逆轉anti-miR-323對缺氧處理心肌H9C2細胞的保護作用

與hypoxia+anti-miR-con+si-con組比較，anti-miR-323和si-FGF9共轉染顯著降低缺氧處理的H9C2細胞活力(P<0.05)，見圖5A，提高細胞凋亡率和cleaved caspase-3的蛋白水平，降低FGF9的蛋白水平(P<0.05)，見圖5B、C。

Figure 3. miR-323 specifically regulated the expression of FGF9 in the H9C2 cells. A: the 3’UTR of FGF9 contained nucleotide sequences complementary to miR-323; B: dual-luciferase reporter assay; C: the effect of miR-323 on the protein expression of FGF9 determined by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-con group.

圖3 miR-323靶向調控H9C2細胞FGF9的表達

Figure 4. Over-expression of FGF9 promoted the viability of H9C2 cells exposed to hypoxia and inhibited cell apoptosis. A: the changes of the cell viability; B: the changes of the apoptosis rate; C: the results of Western blot for determining the effects of FGF9 over-expression on the protein levels of FGF9 and cleaved caspase-3 in H9C2 cells exposed to hypoxia. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vspcDNA group.

圖4 過表達FGF9增強缺氧處理的心肌H9C2細胞活力和抑制細胞凋亡

Figure 5. The effects of FGF9 and anti-miR-323 on the viability and apoptosis of hypoxia-treated H9C2 cells. A: the effects of FGF9 and anti-miR-323 on the viability of H9C2 cells under hypoxia; B: the effects of FGF9 and anti-miR-323 on the apoptosis of hypoxic-treated H9C2 cells; C: the results of Western blot for determining the effects of FGF9 and anti-miR-323 on the protein levels of FGF9 and cleaved caspase-3 in hypoxia-treated H9C2 cells. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vshypoxia+anti-miR-con group;&P<0.05vshypoxia+anti-miR-con+si-con group.

圖5 FGF9和anti-miR-323對缺氧處理心肌H9C2細胞活力和凋亡的影響

6 miR-323調控FGF9對JNK和p-JNK蛋白水平的影響

Western blot檢測H9C2細胞中JNK和p-JNK的蛋白水平，發現缺氧處理、下調miR-323表達或下調FGF9表達均不影響細胞中JNK表達，但缺氧處理組和hypoxia+anti-miR-con+si-FGF9組較相應的對照組細胞中p-JNK表達量顯著增加，下調miR-323表達較hypoxia+anti-miR-con組明顯降低缺氧處理H9C2細胞中p-JNK的蛋白水平(P<0.05)，見圖6。

討 論

miRNA約有22個核苷酸長度，通過與下游靶基因3’UTR序列特異性結合，調控基因表達，參與細胞生長、分化和周期等生物學過程[10]。越來越多的證據表明，miRNA在缺氧誘導心肌細胞損傷的發生發展中扮演著重要角色[11-12]。高表達miR-22可以保護體外培養的缺氧心肌細胞損傷，提高細胞活力，減少細胞凋亡[13]。miR-145-5p可作為心肌細胞保護分子，通過調節CD40改善缺氧誘導心肌細胞的炎癥反應，減輕細胞凋亡[14]。下調miR-122保護心肌 H9C2細胞免受缺氧誘導的凋亡，增強缺氧誘導的H9C2細胞的活力[15]。本研究發現缺氧處理以時間依賴方式抑制H9C2細胞的活力，促進細胞凋亡。miR-323在缺氧12 h、24 h和48 h處理的H9C2細胞中表達上調。下調miR-323表達顯著提高缺氧處理H9C2細胞活力，降低細胞凋亡率，與下調miR-122表達的作用[15]一致。另外，下調miR-323表達明顯提高缺氧處理H9C2細胞后cleaved caspase-3的水平。這些結果說明下調miR-323表達可以保護心肌H9C2細胞免受缺氧損傷。

Figure 6. The protein levels of JNK and p-JNK in H9C2 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vshypoxia+anti-miR-con group;&P<0.05vshypoxia+anti-miR-con+si-con group.

圖6 Western blot檢測心肌H9C2細胞中miR-323調控FGF9對JNK和p-JNK蛋白水平的影響

FGF9是成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，FGFs)家族一員，FGFs主要包括23個成員[16]，多個成員如FGF2、FGF19和FGF21等具有保護心肌的作用[17-20]，其中，FGF9與缺氧心肌細胞損傷密切相關，可能成為缺氧心肌細胞損傷的潛在治療靶點。FGF9在缺血缺氧心肌細胞中表達下調，抑制FGF9表達可以促進缺血缺氧損傷的心肌細胞凋亡；FGF9通過PI3K/AKT信號通路激活來抑制心肌細胞凋亡[21]。FGF9可以拮抗小鼠糖尿病心肌梗死[22]。本實驗中，缺氧處理H9C2細胞后，FGF9蛋白表達顯著下調，過表達FGF9明顯增加缺氧處理H9C2細胞活力，降低細胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白水平，提示FGF9參與缺氧誘導心肌H9C2細胞損傷進程，并且過表達FGF9可減輕缺氧心肌H9C2細胞的損傷，這與前人的研究結果[21-22]相符。

研究表明，miRNA通過靶向其下游靶基因，調節缺氧誘導的心肌細胞增殖、凋亡等過程，如miR-503通過靶向IGF-1R促進缺氧條件下心肌H9C2細胞凋亡[23]，過表達miR-150通過靶向葡萄糖調節蛋白-94抑制缺氧誘導的人心肌細胞的凋亡[24]。為了進一步研究下調miR-323表達見清缺氧H9C2細胞損傷的分子機制，我們運用生物學信息結合雙螢光素酶基因報告實驗證實FGF9是miR-323的靶基因。在細胞中上調或下調miR-323表達顯著調控FGF9表達。過表達FGF9與下調miR-323表達對缺氧處理H9C2細胞的作用結果相同。另外，下調FGF9表達逆轉了下調miR-323表達對缺氧處理H9C2細胞活力的促進作用，以及逆轉對細胞凋亡、cleaved caspase-3蛋白水平的抑制作用，說明FGF9是miR-323影響缺氧處理H9C2細胞凋亡的功能性靶基因。JNK信號通路是影響細胞凋亡的主要信號通路之一，當受到外界刺激時，JNK發生磷酸化，形成p-JNK，參與細胞生長、發育和凋亡等生理過程[25-27]。缺氧復氧處理H9C2細胞p-JNK的水平升高[28]，丁香酸下調p-JNK的水平，抑制JNK信號通路活性可減輕缺氧復氧損傷后H9c2細胞凋亡[29]。miR-486通過靶向NDRG2滅活JNK/c-Jun信號通路，從而減輕缺氧誘導的心肌細胞H9C2損傷[30]。本研究中，下調miR-323表達明顯抑制JNK信號通路p-JNK的水平，下調FGF9表達可逆轉這種抑制作用，表明miR-323對缺氧導致心肌H9C2細胞凋亡的影響與FGF9表達、JNK信號通路密切相關。

綜上所述，miR-323通過靶向調控FGF9表達，并調控JNK信號通路，從而影響缺氧誘導心肌細胞H9C2凋亡。