MDA-MB-231乳腺癌細胞兩種低氧模型的建立與比較分析*

方天星， 倪玉芳， 賴德平， 曾凡才△

(西南醫科大學 1基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室， 2公共衛生學院， 四川 瀘州 646000)

細胞處于低氧狀態是一種普遍存在于生物機體內的生理和病理生理現象。隨著低氧時間、程度以及環境的改變, 低氧環境對于細胞的影響既可是積極的，也可以是消極的。特別是在哺乳動物的胚胎發育過程中，子宮內環境氧體積分數在1%～5%(pO20.5～30 mmHg)之間，這種低氧環境可促進大多數器官的發育及形態形成[1]。此外，在實體瘤中，隨著腫瘤細胞的快速增殖，迅速消耗了正常血管系統的營養和氧氣供應，誘發腫瘤內部的低氧。這種低氧環境使腫瘤有更高的局部復發率和遠處轉移率，以及更低的遠期生存率[2-3]。研究發現低氧與乳腺癌的侵襲性密切相關，腫瘤侵襲性可增加乳腺癌細胞轉移風險以及對放化療的抵抗等[4-5]。細胞為適應低氧環境，低氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是起關鍵性作用的轉錄因子。HIF-1是由α和β 兩個亞基組成的異二聚體蛋白，其中HIF-1β是組成性表達，而HIF-1α是HIF-1獨有的受氧濃度調節的蛋白質。在常氧條件下細胞表達的HIF-1α會快速降解，但在低氧狀態下卻保持穩定，與HIF-1β形成轉錄因子HIF-1后調節多種基因的表達[6],因此，HIF-1α對HIF-1的活性起決定性作用。

既然腫瘤細胞常處于低氧環境，因此選擇恰當的低氧細胞模型研究低氧對腫瘤細胞作用的分子機制十分重要。目前，模擬細胞低氧主要有兩類方法，一類是用可調節氧氣濃度的低氧小室或者三氣培養箱來培養細胞的物理低氧模型；另一類則是用化學低氧模擬劑處理細胞的化學低氧模型，如HIF-脯氨酰羥化酶抑制劑二甲基草酰甘氨酸(dimethyloxalylglycine，DMOG)、甲磺酸去鐵胺(deferoxamine，DFO)和CoCl2等[7]。本研究首先建立目前實驗室運用較廣泛的三氣培養法和化學試劑CoCl2法兩種低氧乳腺癌細胞模型，然后探討兩種低氧模型在HIF-1α的表達與穩定性以及細胞活力、凋亡、侵襲與遷移等方面的差異，為低氧細胞模型的選擇和腫瘤細胞的低氧研究提供參考。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231購于中科院上海細胞庫。CoCl2購自Sigma；基質膠(Matrigel)和凋亡試劑盒Annexin V PE Apoptosis Detection Kit I均購自BD；CCK-8試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Solarbio；Transwell小室購自Millicell；Leibovitz′s L-15培養基和胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)購自Gibco；兔抗HIF-1α(ab2185)、兔抗基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)(ab37150)和鼠抗Bcl-2(ab117115)抗體均購自Abcam。

2 實驗方法

2.1兩種低氧模型的構建 MDA-MB-231乳腺癌細胞置于含10%胎牛血清的Leibovitz′s L-15培養基中培養，根據細胞生長情況2～3 d進行換液或者傳代。常氧培養條件為溫度37 ℃，空氣，100%濕度。兩種低氧模型分別為化學低氧模型和物理低氧模型。為建立化學低氧模型，首先以滅菌注射用水配制濃度為10 mmol/L CoCl2貯存液，再用貯存液配制50～300 μmol/L 不同CoCl2濃度的Leibovitz′s L-15培養基，分別培養細胞24 h、48 h和72 h形成模擬低氧環境。物理低氧模型采用三氣培養箱進行培養，設置氧體積分數梯度分別為1%、2%和5%，其中每一個氧濃度梯度下再選擇3個時點，分別為4 h、16 h和24 h。為便于同時檢測3個時點的樣品以減少實驗誤差，所有細胞均在常氧條件下預培養過夜后，先將24 h處理組放入三氣培養箱；8 h后，再將16 h處理組放入三氣培養箱；繼續培養12 h后，又將4 h處理組放入三氣培養箱；再繼續培養4 h，同時取出3個處理時點的細胞樣品進行蛋白提取，并嚴格控制在5 min內完成從三氣培養箱取出到刮取細胞至離心管這一系列操作。

2.2CCK-8法檢測細胞活力 取對數生長的MDA-MB-231細胞，在96孔板中加入100 μL(密度5×107/L)的細胞懸液。將培養板在培養箱中預培養過夜，化學低氧細胞以含有不同CoCl2濃度的培養基分別處理24 h、48 h和72 h；物理低氧細胞置于2% O2處理24 h，處理時間結束后，棄去培養基同時每孔加入100 μL CCK-8反應液(10 μL CCK-8+90 μL無血清培養基)，繼續孵育3 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(A)值。實驗每組設置3個復孔，重復3次。

2.3Western blot實驗 收集6孔板細胞，從離開培養環境開始計時，預冷PBS洗滌細胞2次，每孔加入150 μL RIPA裂解液，刮取貼壁細胞至離心管這一系列操作嚴格控制在5 min內。隨后冰上裂解10 min。10%的超聲強度冰上超2 s，停3 s，重復5次、4 ℃，16 000 r/min 離心10 min，吸取上清BCA測定總蛋白濃度。其余加入5×上樣緩沖液至終濃度為1×，沸水煮沸5 min后，冰上放置2 min。SDS-PAGE分離蛋白，電轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，4 ℃過夜孵育 I 抗，TBST洗膜15 min后，用HRP標記的 II 抗溶液在室溫孵育1 h，TBS洗膜5 min后化學發光顯色。

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 化學低氧細胞以含有100 μmol/L CoCl2的培養基處理24 h，物理低氧細胞置于2% O2處理24 h。處理時間結束后，用不含EDTA的胰酶同時消化細胞，收集細胞使每組細胞密度不少于1×105個。預冷的PBS洗滌細胞2次，1 000×g離心5 min，為避免細胞被吸棄，小心吸棄并保留30 μL左右上清。加入500 μL的binding buffer充分懸浮細胞，依次加入5 μL PE-annexin V和5 μL 7-氨基放線菌素D (7-aminoactinomycin)混勻后，室溫避光孵育15 min，1 h內上流式細胞儀檢測。

2.5Transwell實驗 4 ℃過夜溶解Matrigel，之后在預冷的Transwell侵襲小室中每孔加入100 μL稀釋好的Matrigel(無血清培養基稀釋至濃度為1.0 g/L)，置37 ℃、無CO2孵箱中培養4 h。細胞用胰酶消化，稀釋成1×109/L的無血清的細胞懸液，化學低氧細胞添加CoCl2使其終濃度100 μmol/L。Transwell侵襲小室中每孔加200 μL細胞懸液，同時在侵襲小室的下室中加入600 μL含20% FBS培養基，以便形成趨化梯度。培養24 h后，取出侵襲小室，棄去其中的細胞培養液，用棉簽拭去小室內表面的細胞，然后PBS漂洗2次。隨后固定液室溫固定20 min，PBS漂洗2次；0.5%結晶紫染液室溫染色30 min，PBS漂洗2次，顯微鏡觀察，成像。

2.6細胞劃痕實驗 在24孔板中加入1 mL細胞懸液(密度2×108/L)，培養過夜觀察細胞密度達80%～90%，用10 μL移液槍輕輕劃線，垂直90度，用力均勻，確保劃線處無細胞，并用PBS液洗滌2次后顯微鏡拍照記錄。然后細胞更換為2% FBS培養基，化學低氧細胞添加CoCl2使其終濃度為100 μmol/L，繼續培養24 h后再次拍照記錄。

3 統計學處理

采用SPSS 22.0統計學軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組比較采用t檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 化學低氧模型的建立

化學試劑CoCl2處理MDA-MB-231細胞24 h，隨著CoCl2濃度的增加，細胞活力呈被抑制趨勢，當CoCl2濃度為300 μmol/L時開始顯著抑制細胞活力(P<0.05)，見圖1A；如果處理時間增加至48 h和72 h，150 μmol/L的CoCl2就開始顯著抑制細胞活力(P<0.01)，見圖1B、C。當CoCl2濃度為100 μmol/L時,處理24 h、48 h和72 h對細胞的活力均無顯著抑制作用，如果將CoCl2濃度增加到150 μmol/L，處理48 h就抑制細胞活力(P<0.05)，72 h差異更顯著(P<0.01)，見圖1D。綜合不同時間及濃度的CCK-8檢測結果，如果CoCl2濃度為100 μmol/L，處理時間24 h將不會抑制細胞活力，但Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，HIF-1α高表達，說明在此條件下即可成功構建化學低氧模型，見圖1E。因此，為了不抑制細胞活力，最終選擇CoCl2處理時間為24 h、處理濃度為100 μmol/L進行后續實驗。

2 物理低氧模型的建立

根據文獻和前期預實驗結果，本實驗設計了3種不同程度低氧(1%、2%和5% O2)和3個時點(4 h、16 h和24 h)來營造低氧環境培養細胞，并利用Western blot檢測HIF-1α蛋白表達(依據抗體說明書，40～80 kD條帶為降解的HIF-1α，110～130 kD條帶為翻譯后修飾的HIF-1α)。結果顯示在不同程度低氧情況下，HIF-1α蛋白表達水平均隨著時間的增加而升高,表明物理低氧模型構建成功，見圖2A～C。從三氣培養箱取出細胞至常氧環境下進行蛋白提取的短時間內，HIF-1α會發生大量降解。如果處理時間為24 h，氧體積分數分別選擇1%、2%和5%，結果顯示2% O2處理細胞的HIF-1α蛋白表達最強,見圖2D。如果2% O2分別處理4 h、16 h和24 h，CCK-8檢測結果顯示，與常氧對照組相比，低氧處理4 h后細胞活力并未發生明顯改變，16 h和24 h細胞活力明顯受到抑制(P<0.01)，見圖2E。這一結果提示物理低氧抑制細胞活力呈時間依賴性。因此，后續物理低氧模型選擇2% O2處理細胞24 h。

3 兩種低氧模型中HIF-1α蛋白表達的差異

由于化學低氧和物理低氧屬于兩種不同類型的細胞模型，而HIF-1α蛋白是細胞在低氧狀態下的核心分子。比較兩種模型的HIF-1α蛋白表達情況，發現存在明顯差異。物理低氧細胞的HIF-1α蛋白表達明顯高于化學低氧，但未降解HIF-1α蛋白低于化學低氧；兩種低氧模型細胞在70 kD左右的HIF-1α降解蛋白的大小和量也不一致。上述結果說明物理低氧細胞的HIF-1α蛋白量多，特別是氧體積分數為2%時，并且在從低氧裝置取出后進入復氧狀態的短時間內會發生快速降解。化學低氧模型細胞雖然不易受氧體積分數的影響，但也同樣存在HIF-1α蛋白的降解，并且降解的HIF-1α蛋白的分子量與物理低氧有些許差異,見圖3。這說明這兩種低氧模型可能還存在不同的HIF-1α蛋白降解或修飾機制。

Figure 1. Establishment of chemical hypoxia model of MDA-MB-231 cells. A, B and C: the viability of the MDA-MB-231 cells treated with CoCl2at different concentrations for 24 h, 48 h and 72 h, respectively; D: the viability of the cells treated with CoCl2at 100 μmol/L or 150 μmol/L for different time; E: the protein expression levels of HIF-1α in the cells treated with CoCl2at 100 μmol/L for 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;△△P<0.01vscontrol group.

圖1 化學低氧模型的建立

4 兩種低氧模型的細胞凋亡差異

流式細胞術檢測細胞凋亡的結果顯示，對照組凋亡率為1.635%±0.005%，CoCl2處理的化學低氧組凋亡率為1.595%±0.045%，2% O2處理的物理低氧組凋亡率為6.555%±0.275%。以上結果表明，CoCl2處理后未見細胞凋亡發生明顯變化(P>0.05)，而2% O2處理后細胞凋亡率顯著增加(P<0.01)，見圖4A。此外，檢測抗凋亡蛋白Bcl-2的結果顯示，與對照組(常氧)相比，CoCl2組Bcl-2蛋白表達未見明顯變化(P>0.05)，但在1%和2% O2處理后明顯降低(P<0.01),見圖4B。

5 兩種低氧模型的乳腺癌細胞在侵襲和遷移上的差異

當以不同程度低氧處理MDA-MB-231細胞時，1%和2% O2組的MMP-2蛋白表達增加十分明顯，尤以2% O2組最高，5% O2組僅少量增強，見圖5A。

Figure 2. Establishment of physical hypoxia model of MDA-MB-231 cells. A, B and C: the expression levels of HIF-1α in the MDA-MB-231 cells exposed to different volume fractions of oxygen for different time were assessed by Western blot; D: the protein expression levels of HIF-1α in the cells exposed to different volume fractions of oxygen for 24 h (n=3); E: the effects of 2% O2on the cell viability (n=4). Mean±SD.**P<0.01vscontrol group.

圖2 物理低氧模型的建立

Figure 3. The differences in protein expression levels of HIF-1α between the 2 hypoxia models of MDA-MB-231 cells. For physical hypoxia model, the cells were exposed to hypoxia with different volume fractions of oxygen for 24 h, and for chemical hypoxia model, the cells were treated with CoCl2at concentration of 100 μmol/L for 24 h. The expression levels of HIF-1α were assessed by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 兩種低氧模型中HIF-1α蛋白表達的差異

化學低氧組的MMP-2蛋白表達也比對照組有所增加，但幅度低于1%和2% O2組，見圖5B。由于物理低氧模型會造成細胞凋亡，故不能利用Transwell和細胞劃痕實驗進一步展示細胞侵襲和遷移能力的變化，但對化學低氧模型細胞進行了檢測。Transwell結果顯示，經CoCl2處理24 h后，細胞的侵襲能力顯著增強，侵襲細胞數目約為對照組的2～3倍(P<0.01)，見圖5C。細胞劃痕實驗結果表明，經CoCl2處理細胞的遷移能力也明顯增強(P<0.05)，見圖5D。

Figure 4. The differences in apoptosis of the MDA-MB-231 cells between the 2 hypoxia models. A: for chemical hypoxia model, the cells were treated with CoCl2at concentration of 100 μmol/L for 24 h, and for physical hypoxia model, the cells were exposed to hypoxia with 2% oxygen for 24 h, then the cell apoptosis was analyzed by flow cytometry; B: the results of Western blot for determining the protein expression levels of Bcl-2 in the MDA-MB-231 cells treated with CoCl2; C: the results of Western blot for determining the protein expression levels of Bcl-2 in the cells exposed to different volume fractions of oxygen. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4 兩種低氧模型細胞凋亡的差異

討 論

據報道，發生于女性的惡性腫瘤中，僅乳腺癌就占據30%[8]，其中又以三陰性乳腺癌侵襲性強，惡性程度高，預后差[9-10]。研究表明在正常乳腺組織中，平均氧濃度為8.6%，但是在乳腺癌組織中，平均氧濃度低至1.5%[11-12]。由此可見低氧環境對乳腺癌的發生和發展具有重要的意義。研究發現細胞只在低氧狀態下能保持HIF-1轉錄因子的活性，但在常氧條件下會發生快速降解[13],其分子機制是在常氧時，HIF-1的HIF-1α亞基的氧依賴降解結構域中脯氨酸殘基會在脯氨酰羥化酶催化下與O2發生羥化反應，羥化的HIF-1α可被von Hippel-Lindau(VHL)抑癌基因產物pVHL蛋白特異結合，此結合蛋白經泛素化修飾后降解。因此，HIF-1轉錄因子在常氧環境下無活性。但在低氧環境下，由于氧濃度不足，脯氨酰羥化酶不能將HIF-1α蛋白羥化，不發生HIF-1α蛋白的快速降解。HIF-1α可進入細胞核與HIF-1β形成異二聚體HIF-1轉錄因子，調節一系列基因的表達，發揮相應生物學效應[14],上述機制即為物理低氧細胞模型的工作原理。另有研究發現，化學試劑CoCl2的Co2+可置換脯氨酰羥化酶的Fe2+,從而抑制脯氨酰羥化酶的活性，以阻止HIF-1α被羥基化后降解[15]。這是CoCl2處理的化學低氧細胞模型的工作原理。兩種模型均會保持HIF-1α蛋白的穩定，使HIF-1發揮轉錄因子的作用。

乳腺癌細胞MCF-7對于不同濃度CoCl2的耐受能力差別較大[16]。本實驗結果顯示，CoCl2對MDA-MB-231細胞活力的抑制同樣呈現時間及濃度依賴性，但可以找到對細胞活力影響小的濃度和時點; 而物理低氧模型卻不易找到對細胞活力影響小的時點。4 h的時間太短，細胞還未完成分裂，16 h和24 h的低氧環境均會抑制細胞活力。畢竟由于工作原理的差異，兩種類型低氧模型中低氧的核心分子HIF-1α蛋白的表達和穩定性也存在一定的差異。首先，從量上看物理低氧的HIF-1α蛋白比化學低氧更多，且差異十分顯著；其次，從穩定性上看將物理低氧的細胞從低氧培養箱取出到提取蛋白的很短復氧時間內，HIF-1α即可發生快速降解。按照工作原理，化學低氧的細胞應該不會發生降解，但Western blot結果顯示也有一定的降解，只是降解的比例小于物理低氧。其原因可能是為了不影響細胞生長而選擇低濃度的CoCl2，但低濃度的CoCl2對脯氨酰羥化酶活性的抑制不完全，會使部分HIF-1α蛋白發生降解。此外，化學低氧降解條帶的大小與物理低氧略有差異，說明可能這兩種模型的HIF-1α蛋白降解和修飾機制有一定程度的不同[17]。

Figure 5. The differences in the invasion and migration ablilites of the MDA-MB-231 cells between the 2 hypoxia models. For physical hypoxia model, the cells were exposed to hypoxia with different volume fractions of oxygen for 24 h, and for chemical hypoxia model, the cells were treated with CoCl2at concentration of 100 μmol/L for 24 h. A and B: the images of Western blot for determining the protein expression of MMP-2; C: the cell invasion ability detected by Transwell assay; D: the cell migration ability assessed by wound-healing assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5 兩種低氧模型的乳腺癌細胞在侵襲和遷移上的差異

有文獻證實，HIF-1α可能主要通過調節Bcl-2家族蛋白[18]的表達而非P53途徑來發揮抗A549細胞的凋亡作用[19]。本研究中2% O2處理后細胞凋亡增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，提示HIF-1α可能下調Bcl-2表達并誘導MDA-MB-231細胞凋亡。而與對照組相比，CoCl2處理組未檢測到細胞凋亡增加和Bcl-2蛋白的明顯變化，其原因應該是化學低氧模型是將CoCl2處理濃度和時間控制在適宜范圍內，從而避免了凋亡細胞的增加。

MMP-2蛋白通過降解Ⅳ型膠原促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[20]。有文獻證實，低氧環境下乳腺癌細胞通過依賴膜型基質金屬蛋白酶1(MT1-MMP)活化MMP-2酶原而促進侵襲[21]。本實驗結果顯示，1%和2% O2處理后MMP-2蛋白表達特別強，尤其是在2% O2處理后，但在5% O2處理后僅有少量增加。在低氧狀態下，MMP-2表達如此強，說明低氧狀態下的乳腺癌細胞轉移能力會增強[22]。而在5% O2處理后MMP-2表達增加不多，其原因可能與O2體積分數要低于5% HIF-1α蛋白才穩定有關[23]。雖然在低氧狀態下MMP-2蛋白大量表達，但是由于低氧會影響細胞的增殖，無法用Transwell和劃痕實驗觀察細胞的侵襲和遷移能力。不過對于CoCl2處理的化學低氧模型，同樣觀察到了MMP-2蛋白表達增加，并通過Transwell和劃痕實驗檢測細胞侵襲及遷移能力的增強，說明低氧環境能夠增強乳腺癌細胞的侵襲及遷移能力。

綜上所述，雖然這兩種都是常用低氧模型，但由于工作原理的差別，實驗結果存在一定的差異。不過這兩種模型都是使HIF-1α蛋白不降解，以保證HIF-1發揮轉錄因子的作用。因此，各實驗室可根據自身實驗條件和實驗方案的需要，選擇一種方式建立低氧模型進行研究。如果條件允許，我們推薦物理低氧模型，畢竟它才是真實的低氧環境。而且物理低氧模型細胞會有更強的HIF-1α和MMP-2蛋白表達，也不用擔心化學低氧模擬劑作用于細胞內的其它分子導致結果差異。