叉頭框蛋白O1在內毒素血癥急性腎損傷中的作用*

張夢希， 董 偉， 李志蓮， 校振萌, 3， 李銳釗， 陳源漢， 梁馨苓, 3△

[1南方醫科大學第二臨床醫學院， 廣東 廣州 510515； 2廣東省人民醫院(廣東省醫學科學院)腎內科， 廣東 廣州 510080； 3華南理工大學醫學院， 廣東 廣州 510006]

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是威脅人類健康的常見危重癥，其特征是腎臟損傷及腎功能急劇下降。據統計，在ICU中，AKI的發生率可高達38%～51%[1],其中膿毒血癥AKI的發生率約占全部類型AKI的50%，目前已經成為我國社區獲得性AKI的首位原因，院內獲得性急性腎損傷的第2位原因[2]。膿毒血癥AKI預后不良，目前臨床尚缺乏防治膿毒血癥AKI的有效藥物，因此找尋膿毒血癥AKI發病機制中的新靶點具有重要的臨床意義。內毒素及其所觸發的炎癥因子瀑布效應對腎小管上皮細胞損傷是引起膿毒血癥AKI的重要因素[3]，但具體分子機制尚不十分明確。叉頭框蛋白O(forkhead box protein O，FOXO)是FOX家族的一個亞群，從蠕蟲到人類均有表達。該亞群有4個成員，分別是FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6，其中，FOXO1是FOXO家族中最早發現的成員之一[4]。FOXO1作為一種轉錄因子，可與細胞核內DNA上的反應元件結合，激活靶基因，在DNA損傷/修復、應激、血管生成、糖代謝和腫瘤發生等多過程中發揮著關鍵性的作用[5]。既往研究發現，FOXO1可在足細胞、腎小管上皮細胞和系膜細胞等多種腎實質細胞中廣泛表達，并在糖尿病腎病、腎臟纖維化及狼瘡性腎炎等多種疾病中發揮作用[6-8]。但是在內毒素血癥AKI中，關于FOXO1的研究尚缺乏，本研究旨在探討腎小管上皮細胞FOXO1是否參與了內毒素血癥AKI的發生及其相關機制。

材 料 和 方 法

1 主要材料及試劑

24只6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心(合格證號：No.44005800008550)。人近端腎小管上皮HK-2細胞購自美國模式培養物集存庫。DMEM/F12和胎牛血清(Gibco)；抗FOXO1抗體、山羊抗兔 II 抗和DAPI(Cell Signaling Technology)；抗過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α, PGC-1α)抗體和抗Bax抗體(Abcam)；抗GAPDH抗體(Bioworld)；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS; Sigma,Escherichiacoli055:B5)；Ad-FOXO1(漢恒生物)；MTT(MP Biome-dicals)；MitoTracker Red CMXRos和MitoSOX Red(Invitrogen)；血清肌酐(serum creatinine, SCr)試劑盒(Cayman)；血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)試劑盒(索萊寶)。

2 方法

2.1內毒素血癥AKI小鼠模型的構建 采用隨機數表法將24只小鼠隨機分為4組(n=6)：空白對照(control)組、6 h組、12 h組和24 h組。后3組分別在小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg)后的6 h、12 h和24 h行眼球取血并處死，control組小鼠腹腔注射生理鹽水。LPS濃度設置及時點選取參考以往的文獻報道[9]。

2.2HK-2細胞的培養 配制含5%胎牛血清的DMEM/F12完全培養基，將細胞置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養，使用0.05%胰酶(含EDTA)進行傳代，每4～5 d傳代1次。取處于對數生長期并且狀態良好的細胞進行后續實驗。

2.3FOXO1過表達腺病毒感染實驗 將HK-2細胞接種于6孔板，待HK-2細胞融合率達40%～50%，棄去培養基，6孔板每孔加2 mL無血清培養基及1 μL病毒液，培養24 h后換液，改用完全培養基繼續培養48 h后收集細胞進行檢測。

2.4MTT法檢測HK-2細胞活力 取對數生長期的HK-2細胞接種于96孔板，分為對照組及LPS(10、20、40和80 mg/L)組。每組設置5個復孔，同時設置空白孔(在96孔板中直接加入培養基)，藥物干預結束后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L，即0.5% MTT)繼續培養4 h，培養結束后小心吸出孔內培養液，每孔加150 μL二甲基亞砜，置搖床上避光振蕩10 min，酶標儀檢測各孔在560 nm處的吸光度值(A值)。細胞相對活力(%)=(處理組A值-空白孔A值)/(對照組A值-空白孔A值)×100%。

2.5MitoTracker染色 將細胞種植于共聚焦顯微鏡專用培養皿里，待細胞完全貼壁后進行染色。棄去舊培養基，加少量無血清培養基沖洗3次，每皿加入500 μL MitoTracker Red CMXRos工作液(1∶5 000，200 nmol/L),于37 ℃孵箱中避光孵育25 min，棄去染液，PBS洗3次，最后加入500 μL無血清培養基孵育細胞，準備用激光共聚焦顯微鏡拍照。正常細胞內線粒體呈絲線狀，而損傷時的線粒體可出現腫脹及片段化改變[10]。

2.6Western blot實驗 每個樣本取50 μg總蛋白，使用8% SDS-PAGE，上樣后100 V電泳90 min，PVDF膜200 mA轉膜120 min。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜后加入 I 抗[分別為 FOXO1(1∶1 000)、PGC-1α(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)]4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3次，每次5 min, II 抗(1∶3 000)室溫孵育1 h。洗膜后ECL法顯色。使用ImageJ軟件對Western條帶灰度進行半定量分析，以GAPDH為內參照。

2.7RT-qPCR實驗 根據TRIzol說明書操作一步法提取總RNA，采用核酸定量儀 NanoDrop Lite測定樣本RNA濃度，且A260/A280比值應為1.8～2.0，提示樣本中RNA純度合格。樣品-80 ℃保存備用。各引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

逆轉錄反應體系為20 μL。反應條件為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，1個循環。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性10 s、60 ℃退火25 s、72 ℃延伸25 s，此3步共循環40次；72 ℃終止5 min。每個樣本設2個復孔，定量結果取平均值。

2.8MitoSOXTM染色 用13 μL二甲基亞砜溶解50 μg MitoSOXTM試劑，配制5 mmol/L儲存液。使用時用無血清培養基稀釋成5 μmol/L工作液，6孔板每孔加1.0～2.0 mL，于37 ℃孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min,準備用激光共聚焦顯微鏡拍攝。

3 統計學處理

用SPSS 20.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 內毒素血癥AKI時小鼠腎臟FOXO1 mRNA及蛋白表達下調

小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg)后6 h、12 h和24 h行眼球取血并處死，獲取小鼠血清及腎組織標本，結果顯示，小鼠SCr和BUN隨時間延長呈上調趨勢，且在24 h上升最為顯著(P<0.05)，見圖1A;小鼠腎組織病理染色結果顯示，LPS腹腔內注射24 h后，皮質及外髓質腎小管上皮細胞出現輕微的腫脹及空泡樣變性、管腔狹窄，見圖1B;腎組織電鏡可見，LPS 24 h組小鼠腎小管上皮細胞內線粒體腫脹、嵴消失，空泡樣變性，見圖1C。上述結果提示LPS可誘導小鼠出現內毒素血癥急性腎損傷。Western blot結果顯示，與對照組相比，LPS各組FOXO1蛋白表達量下調，且在24 h組下調最為顯著(P<0.05)，見圖1D。FOXO1在腎組織中廣泛表達，小鼠腎組織免疫熒光可見FOXO1在腎小管(尤其是近端腎小管)上皮細胞中表達量較高，在腎小球中表達量相對較低。與對照組相比，LPS誘導的內毒素血癥AKI小鼠腎組織中FOXO1下調(紅色熒光示FOXO1，藍色示細胞核)，見圖1E。提取小鼠腎皮質RNA，RT-qPCR結果顯示FOXO1轉錄水平下降(P<0.05),見圖2。上述結果提示，腎小管上皮細胞FOXO1可能參與了內毒素血癥AKI的發生發展。與此同時，線粒體氧化磷酸化相關基因(PGC-1α、線粒體復合體I亞基Ndufs1和線粒體復合體V亞基Atp5o)的轉錄均下調(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. The expression of FOXO1 in kidney of mice was down-regulated during LPS-induced AKI. A: blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (SCr) were increased after LPS injection; B: periodic acid-Schiff (PAS) stainning (×400) indicated vacuolar deformation and swelling of renal tubular epithelial cells; C: electron microscopy (×39 000) showed that mitochondrial injury in tubular epithelial cells, as exhibited by the disorder or disappearance of crista, and mitochondrial swelling and deformation, was aggravated in the LPS group; D and E: Western blot and immunofluorescence (×400) revealed that FOXO1 protein in mouse kidney tissue was down-regulated over time. MFI: mean fluorescence intensity. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1 內毒素血癥AKI時，小鼠腎臟FOXO1表達下調

Figure 2. The mRNA expression of FOXO1, PGC-1α, Ndufs1 and Atp5o was down-regulated during LPS-induced AKI. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖2 內毒素血癥AKI時，小鼠腎臟FOXO1及線粒體氧化磷酸化相關基因mRNA表達下調

2 LPS誘導HK-2細胞FOXO1 mRNA及蛋白表達下調

為檢測內毒素血癥AKI對腎小管上皮細胞FOXO1表達的影響，本研究用LPS(濃度為40 mg/L)干預HK-2細胞48 h。Western blot實驗結果發現LPS可誘導HK-2細胞內FOXO1蛋白的表達量下調(P<0.05)，見圖3A。RT-qPCR結果提示，FOXO1的mRNA也出現下調(P<0.05),見圖3B。同樣地，免疫熒光結果顯示，與對照組相比，LPS處理組的HK-2細胞內FOXO1熒光強度較弱(P<0.05),見圖3C。這些體外實驗結果與前述動物實驗所觀察到的現象一致，因而進一步證明了內毒素血癥可誘導腎小管上皮細胞FOXO1 mRNA及蛋白表達水平下降。

3 過表達FOXO1減輕LPS誘導的HK-2細胞線粒體損傷

LPS可誘導HK-2細胞內FOXO1下調，同時引起線粒體生物合成關鍵調控分子PGC-1α下調以及促凋亡因子Bax上調;利用過表達腺病毒載體對人FOXO1基因進行構建及包裝，并用該病毒感染HK-2細胞,結果發現FOXO1過表達上調了PGC-1α，并下調了Bax蛋白水平(P<0.05)，見圖4A。采用不同濃度(10、20、40和80 mg/L)的LPS刺激HK-2細胞時，細胞活力呈不同程度下降，而FOXO1過表達腺病毒組在不同LPS濃度條件下的細胞活力均高于空病毒載體組(P<0.05)，見圖4B。這提示FOXO1過表達可逆轉LPS誘導的腎小管上皮細胞活力下降。利用活細胞線粒體染料Mitotracker標記HK-2細胞線粒體，發現LPS刺激可引起腎小管上皮細胞線粒體呈現片段化改變，而過表達FOXO1可減輕LPS引起的這種線粒體片段化(紅色示線粒體)，見圖4C。MitoSOXTM染色可標記線粒體超氧化物，反映線粒體氧化呼吸功能損傷程度。LPS刺激下，HK-2細胞線粒體產生大量超氧化物，MitoSOXTM染色呈強陽性；FOXO1過表達后，超氧化物產生量較LPS刺激時減少，見圖4D。此外，RT-qPCR分析發現，LPS刺激HK-2細胞可引起線粒體復合體I亞基Ndufb8和線粒體復合體V亞基Atp5g1這兩個線粒體氧化磷酸化相關基因的mRNA水平下調，而過表達FOXO1可減輕該下調程度(P<0.05)，見圖4E。由此可見FOXO1過表達可減輕LPS引起的HK-2細胞線粒體損傷及氧化磷酸化功能障礙。

Figure 3. FOXO1 protein and mRNA expression was down-regulated in the HK-2 cells induced by LPS. Western blot (A), RT-qPCR (B) and immunofluorescence (C; ×400) for deteting the expression of FOXO1 in HK-2 cells that have undergone different interventions. MFI: mean fluorescence intensity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 LPS誘導HK-2細胞內FOXO1轉錄及表達下調

討 論

LPS是革蘭氏陰性菌內毒素，是膿毒血癥炎癥反應的主要致病因子之一。LPS不僅可觸發大量炎癥因子瀑布效應，而且可通過活化Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)直接誘導腎小管上皮細胞損傷[11],因此采用LPS構建內毒素血癥模型可以有效且相對合理地模擬膿毒血癥時內毒素對機體的損傷作用。然而，內毒素血癥引起AKI的具體分子機制尚不明確。既往研究發現，FOXO家族在腎臟中廣泛表達，參與多種腎臟疾病的發生發展。在糖尿病腎病中存在FOXO1表達及活化障礙并參與疾病發生及進展，足細胞過表達FOXO1可通過活化PTEN誘導激酶(PTEN-induced kinase，PINK)/parkin通路減輕高糖誘導的線粒體自噬和足細胞凋亡[6]；此外，過表達FOXO1還可減輕高糖誘導的系膜細胞PGC-1α下調及線粒體損傷[12]。同時，腎小管上皮細胞過表達FOXO1還可抑制小管間質纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)相關分子如信號傳導及轉錄激活蛋白1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)的表達，從而減輕TIF及小管細胞凋亡[8]。但尚無FOXO1在內毒素血癥AKI中的研究。本研究首次發現，內毒素血癥AKI時腎小管上皮細胞FOXO1 mRNA及蛋白表達下調；并且在細胞模型中，過表達FOXO1可以逆轉LPS誘導的腎小管上皮細胞活力下降，減輕線粒體損傷和氧化磷酸化功能障礙，因此我們推測腎小管上皮細胞FOXO1表達下調可能是內毒素血癥AKI的發病機制之一。

腎臟是人體第二大能量需求器官，其線粒體含量僅次于心臟。在腎小管上皮細胞中線粒體含量十分豐富。線粒體通過其內膜電子傳遞鏈將質子從線粒體基質泵入膜間隙，在內膜上產生電化學梯度，從而驅動二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)磷酸化為三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，用來維持腎小管上皮細胞的電化學梯度及協助溶質運輸，以實現腎臟重吸收等重要生理功能[13]。活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是體內一類氧的單電子還原產物，是電子在未能傳遞到末端氧化酶之前漏出呼吸鏈并消耗大約2%的氧生成的，當線粒體損傷時，電子傳遞鏈功能出現異常，可引起線粒體大量超氧化物產生，對細胞造成氧化損傷[14]。既往研究發現，線粒體損傷是內毒素血癥AKI的重要病理生理改變，由此引起的能量代謝異常以及線粒體超氧化物、細胞色素酶C、凋亡激活因子等釋放所致的腎小管上皮細胞程序性死亡是重癥AKI的關鍵環節[15]。我們的研究發現，內毒素血癥可誘導腎小管上皮細胞活力下降及線粒體損傷，過表達FOXO1可逆轉LPS誘導的HK-2細胞活力下降，減輕線粒體損傷，說明FOXO1確實參與了內毒素血癥AKI腎小管上皮細胞損傷的發生。那么，FOXO1是通過什么機制參與內毒素血癥AKI的呢？FOXO1作為一種重要的轉錄因子，其下游多種轉錄產物超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase，SOD2)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和PGC-1α等均可以影響線粒體能量代謝及再生。其中，PGC-1α是維持線粒體形態及生物合成的“關鍵調控因子”[16]。文獻證實，在急性腎損傷中PGC-1α轉錄及表達下調，繼而引起線粒體功能紊亂及損傷從而介導多種類型AKI的發生[17-18]。在肝細胞等已證實，FOXO1是PGC-1α的上游轉錄因子[19]，并且在糖尿病腎病模型中，也發現過表達FOXO1可以上調PGC-1α[8]，但在腎小管上皮細胞中尚不明確FOXO1是否可調控PGC-1α。在我們的研究中，FOXO1過表達可減輕內毒素所誘導的腎小管上皮細胞活性氧增加，同時可增加PGC-1α轉錄以及PGC-1α下游控制氧化磷酸化的分子——Ndufb8和Atp5g1的轉錄。因此我們推測，在內毒素血癥AKI時腎小管上皮細胞內FOXO1下調可能引起PGC-1α等線粒體功能維持關鍵因子的轉錄下調，導致腎小管上皮細胞線粒體損傷及功能障礙，從而介導內毒素血癥AKI的發生。具體機制我們需要進一步的研究來驗證。

Figure 4. Over-expression of FOXO1 attenuated HK-2 cell injury induced by LPS. A: over-expression of FOXO1 reversed LPS-induced PGC-1α down-regulation and Bax up-regulation in HK-2 cells; B: MTT assay showed that Ad-FOXO1 attenuated LPS-induced cell viability depression; C: MitoTracker staining showed the morphological changes of mitochondria in HK-2 cells (×400); D: MitoSOX staining showed mitochondrial superoxide production in HK-2 cells (×400); E: the mRNA levels of mitochondrial complex I (Ndufb8) and mitochondrial complex V (Atp5g1) were quantified in the mitochondrial fractions. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsvector group.

圖4 過表達FOXO1可減輕LPS誘導的HK-2細胞損傷

綜上所述，本研究發現腎小管上皮細胞FOXO1水平下調介導內毒素血癥AKI腎小管上皮細胞損傷這一新的機制。該研究結果提供了內毒素血癥AKI的新的干預靶點，為內毒素血癥AKI的防治提供了新策略。