SGK1抑制劑EMD638683對膀胱出口梗阻小鼠腎組織細胞焦亡的作用及機制研究

曾琦紋， 陳 林， 邢莎莎， 許 歡， 張亞美， 劉 迅， 楊德華

(1成都大學， 四川 成都 610106； 成都大學附屬醫院 2泌尿外科， 3中心實驗室， 4藥物臨床試驗中心， 四川 成都 610081)

后尿道瓣膜(posterior urethral valves, PUV)是先天性梗阻性腎病的常見原因，可導致不同程度的膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)[1]，而25%～50%的患者在到達成人時會發展為終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)[2]。梗阻性腎病以炎癥反應為基本特征，具有較高的發病率和死亡率[3]。前期研究中，研究者在小鼠BOO模型中觀察到腎小管炎性損傷[4]。但是，BOO模型導致腎臟損傷的機制不清楚。已經證實炎癥反應在腎臟損傷中發揮著重要作用，是導致慢性炎癥損傷的關鍵機制[3]。NLRP3炎癥小體是一種關鍵的復合蛋白，與腎臟損傷密不可分，它主要激活caspase-1，活化的caspase-1進一步促進炎性因子 IL-1β 和 IL-18 的切割和成熟從而導致炎癥[5]。細胞焦亡是一種促炎性細胞死亡，其在梗阻性腎病的發生發展中起著重要作用。NLRP3、caspase-1和IL-1β是腎臟細胞焦亡路徑的關鍵因子，gasdermin D (GSDMD)是細胞焦亡的關鍵效應分子[6]，即NLRP3/caspase-1信號通路的激活促使成熟的IL-1β等炎性因子產生增多，而導致細胞焦亡發生。研究報道，血清和糖皮質激素調節激酶1(serum and glucocorticoid-regulated kinase 1, SGK1)抑制劑EMD638683通過阻斷NLRP3炎癥小體激活來減弱小鼠心臟炎癥和纖維化[7]。SGK1是絲氨酸/蘇氨酸激酶基因家族的成員，在各種生理和病理生理中起重要作用[8]，并且研究者在梗阻性腎病中觀察到SGK1的過量表達[9]。以上研究表明，SGK1抑制劑EMD638683可能是通過調控NLRP3/caspase-1/pyroptosis信號通路，抑制caspase-1介導的炎性損傷而拮抗細胞焦亡。本實驗采用BOO模型研究小鼠下尿路梗阻介導的腎臟炎性損傷；同時，EMD638683干預經醛固酮(aldosterone,ALD)處理的小鼠腎小管上皮細胞，初步探討SGK1對小鼠腎小管上皮細胞焦亡的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動物 6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠19只，體重(20±2) g，購于成都達碩生物科技有限公司，合格證號SCXK(川)2015-030。所有小鼠被飼養在12 h晝夜交替的環境中，且飼養環境溫度為(20±2) ℃，濕度為(50±2)%。實驗前，所有小鼠進行環境適應性飼養1周以保證小鼠的狀態穩定。

1.2細胞 小鼠腎小管上皮細胞(mouse renal tubular epithelial cells, mRTECs)購于豪地華拓生物科技有限公司，貨號為HTX2460。

1.3藥物和試劑 醛固酮購自北京索萊寶科技有限公司；EMD638683購自MedChemExpress；抗β-actin和F4/80抗體購自武漢三鷹公司；抗NLRP3、caspase-1和SGK1抗體購自Abcam；抗IL-1β和gasdermin D-N末端片段(gasdermin D N-terminal fragment, GSDMD-N)抗體購自Cell Signaling Technology；小鼠IL-1β酶聯免疫檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；DMEM高糖培養液購自Gibco。

2 方法

2.1動物模型制備和分組 6～8周雌性BALB/c小鼠，按照標準的實驗條件飼養，自由進食與飲水，每籠3～4只。動物模型的制備參照Chen等[4]，新型膀胱出口梗阻造模方法即尿道外口縫合法。選取19只小鼠隨機分為4組，正常(control,Ctr)組4只，模型(BOO)組共15只，梗阻時間1周、2周和3周各5只。

2.2細胞培養和分組 小鼠腎小管上皮細胞培養在含有10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液的高糖DMEM培養液中，置于37 ℃，飽和濕度，5% CO2的培養箱中。待細胞的融合率達到85%時，傳代。根據文獻[10]，設置醛固酮濃度梯度分別為0、1、5、10和20 μmol/L，用含有1%的FBS培養液培養24 h后，收集細胞總蛋白或上清。待ALD濃度確定后，設置EMD638683濃度為50 μmol/L[7]，細胞分為正常(Ctr)組、造模(ALD)組和治療(ALD+EMD638683)組，培養24 h后，提取細胞總蛋白或上清。重復3次實驗。

2.3HE染色 腎組織用4%的多聚甲醛溶液固定，乙醇逐級脫水，石蠟包埋，塊切成5 μm厚的切片并用HE染色,高倍鏡觀察腎組織病理改變及炎癥細胞浸潤情況。

2.4PAS染色 腎臟石蠟切片進行脫蠟，高碘酸、Schiff試劑和蘇木素染色，無水乙醇梯度脫水，中性樹膠封片，高倍倒置顯微鏡下觀察腎臟組織病理性形態學變化并采集圖像。

2.5Masson染色 腎臟石蠟切片進行脫蠟，重鉻酸鉀、蘇木素、麗春紅、磷鉬酸和苯胺藍染色，無水乙醇梯度脫水，中性樹膠封片，高倍倒置顯微鏡下觀察腎臟組織病理性形態學變化并采集圖像。

2.6免疫組織化學染色 腎臟石蠟切片進行脫蠟，檸檬酸抗原修復緩沖液抗原修復，內源性過氧化物酶滅活和5%BSA室溫封閉30 min。與Ⅰ抗[抗NLRP3(1∶200)，抗SGK1(1∶100)，抗caspase-1(1∶200)，抗F4/80(1∶200)，抗IL-1β(1∶100)]孵育過夜，相應Ⅱ抗37 ℃恒溫孵育30 min，DAB染色和細胞核復染，中性樹膠封片。高倍倒置顯微鏡下觀察腎臟組織病理性形態學變化并采集圖像。Image-Pro Plus軟件測量陽性表達區域。

2.7Western blot實驗 從腎臟組織和培養的細胞中提取蛋白質樣品。在10%SDS-PAGE分離相等濃度的蛋白質，并將其轉移到PVDF膜上，用含有5%脫脂牛奶的TBS-Tween(0.1%)封閉膜1 h，隨后，將膜與抗NLRP3(1∶1 000)、抗SGK1(1∶1 000)、抗caspase-1(1∶1 000)、抗GSDMD(1∶1 000)和抗 β-actin(1∶1 000，內參照)在4 ℃孵育過夜。用 TBST緩沖液洗滌膜后，與相應的Ⅱ抗室溫孵育1 h，脫色搖床上TBST緩沖液中洗滌5次，每次8 min。將化學發光底物(chemiluminescent substrate)中的A液和B液等體積混合，覆蓋住PVDF膜約2 min后進行顯影。置于蛋白印跡成像系統的顯影平臺上進行顯影成像，保存圖像。使用Image-Pro Plus軟件檢測灰度值，將數據針對β-actin標準化。

2.8酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法 根據制造商的說明書，使用小鼠IL-1β ELISA試劑盒測試細胞上清液中IL-1β的濃度。

3 統計學處理

實驗數據均表示為均數±標準誤(mean±SEM)，至少3次獨立實驗。使用SPSS 22.0進行數據統計分析，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 各組小鼠腎臟組織形態的比較

HE染色顯示，正常組小鼠腎臟結構基本正常，腎間質偶見炎癥細胞浸潤；隨著小鼠的梗阻時間(1、2和3周)的增加，小鼠腎間質炎癥細胞浸潤逐漸增多，與正常組比較，梗阻3周[BOO (3 w)]組小鼠腎間質炎癥細胞浸潤明顯增多，腎小管上皮細胞變性，濁腫。通過PAS染色，與正常組比較，BOO (3 w)組觀察到受損的腎小管(黑色箭頭)。通過Masson染色評估BOO誘導的腎纖維化，正常組小鼠腎間質中沒有膠原沉積，BOO (1 w)和BOO (2 w)組小鼠腎間質偶見膠原沉積(藍色染色)，與正常組比較，BOO (3 w)組腎間質膠原沉積明顯增多。這3種染色的顯微照片見圖1。

Figure 1. The morphologial changes of the mouse kidney tissues in different groups. The scale bars=50 μm. Black arrows indicate renal tubular injury in HE and PAS staining, and collagen deposition in Masson staining.

圖1 各組小鼠腎臟組織形態的比較

2 小鼠腎組織F4/80表達比較

正常組小鼠腎臟僅見少量F4/80陽性表達；與正常組比較，BOO (3 w)組 F4/80陽性表達區域顯著升高(P<0.01),見圖2。

Figure 2. F4/80 expression in the mouse kidney tissues detected by immunohistochemistry. The scale bars=50 μm. Brown areas show the expression of F4/80 protein. Mean±SEM.n=4 in Ctr group;n=5 in BOO (3 w) group.**P<0.01vsCtr group.

圖2 小鼠腎組織F4/80表達比較

3 小鼠腎臟SGK1、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達比較

免疫組化法檢測腎切片中相關蛋白的表達，正常組腎臟組織中SGK1、NLRP3、caspase-1和IL-1β呈弱表達，BOO (3 w)組SGK1、NLRP3、IL-1β和caspase-1主要在腎小管細胞的細胞質中表達，IL-1β在腎小管細胞間質中也有表達。與正常組小鼠比較，BOO (3 w)組腎組織中SGK1、NLRP3、caspase-1和IL-1β表達顯著升高(P<0.01),見圖3。

Figure 3. The expression of SGK1, NLRP3, caspase-1 and IL-1β proteins in the mouse kidney tissues detected by immunohistoche-mistry. The scale bars=50 μm. Brown areas show the expression of the above proteins. Mean±SEM.n=4 in Ctr group;n=5 in BOO (3 w) group.**P<0.01vsCtr group.

圖3 小鼠腎臟SGK1、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達比較

Western blot法檢測腎皮質中相關蛋白的表達，BOO (3 w)組小鼠腎組織SGK1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N和IL-1β蛋白表達顯著高于正常組(P<0.05或P<0.01),見圖4。

Figure 4. The expression of SGK1， NLRP3， caspase-1， GSDMD-N and IL-1β proteins in the mouse kidney tissues detected by Western blot using β-actin as internal reference. Mean±SEM.n=4 in Ctr group;n=5 in BOO (3 w) group.*P<0.05，**P<0.01vsCtr group.

圖4 小鼠腎臟SGK1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N和IL-1β蛋白表達比較

4 不同濃度醛固酮誘導的mRTEC中SGK1、NLRP3及caspase-1蛋白表達比較

mRTECs經不同濃度醛固酮刺激后，SGK1、NLRP3及caspase-1 蛋白表達均增加。與正常組比較，經1、5和10 μmol/L濃度醛固酮刺激的mRTECs中SGK1、NLRP3及caspase-1 蛋白表達顯著升高(P<0.05)；經20 μmol/L濃度醛固酮刺激的mRTECs中SGK1、NLRP3及caspase-1表達較正常組無顯著差異,見圖5。

5 不同濃度醛固酮誘導的mRTECs上清液中IL-1β含量

ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β的水平，結果顯示，用1、5、10和20 μmol/L濃度醛固酮刺激的mRTECs IL-1β分泌水平顯著高于正常組(P<0.01)，見圖6。因此，我們使用經1 μmol/L醛固酮處理的mRTECs進行后續實驗。

6 EMD638683對mRTECs NLRP3-caspase-1-pyroptosis信號通路的影響

與正常組和ALD+EMD638683治療組比較，ALD組SGK1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N和IL-1β蛋白表達均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；ALD+EMD638683治療組SGK1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N和IL-1β表達與正常組比較無顯著差異,見圖7、8。

討 論

梗阻性腎病是腎衰竭的一個重要原因，其基本特征是腎臟的炎癥反應[10]。而炎癥反應是介導許多腎臟疾病(急性腎損傷和慢性腎臟疾病)發展的基礎[11]。本項工作建立小鼠BOO模型，實驗結果證實，隨著小鼠梗阻時間的增加，小鼠腎臟腎小管細胞變形和濁腫、腎間質的糖原沉積和炎癥細胞浸潤是逐漸加重的，即腎臟炎性損傷隨著梗阻時間的延長而逐步加深；同時與正常小鼠比較，梗阻3周小鼠中F4/80陽性表達區域顯著增多，表明梗阻3周小鼠中腎組織損傷加重而引起巨噬細胞浸潤增加。細胞焦亡是一種伴隨著炎癥反應的細胞程序性死亡，兼具凋亡和壞死的特征又有別于之[12]。本研究中，炎癥相關蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β在梗阻3周的小鼠中表達顯著高于正常小鼠；且陽性表達區域主要是在腎臟腎小管細胞。同時，腎臟GSDMD-N在梗阻3周的小鼠中表達也顯著多于正常小鼠，即梗阻性腎病引起腎臟炎癥反應時，細胞焦亡也參與梗阻性腎病引起的腎損傷。

Figure 5. The expression of SGK1, NLRP3 and caspase-1 proteins in mRTECs induced by different concentrations of ALD detected by Western blot using β-actin as internal reference. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsCtr group.

圖5 不同濃度醛固酮誘導的mRTECs中SGK1、NLRP3及caspase-1 蛋白表達比較

Figure 6. The IL-1β levels in supernatants of mRTECs induced by different concentrations of ALD detected by ELISA. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsCtr group.

圖6 不同濃度ALD誘導的mRTECs上清液中IL-1β含量

當機體受到刺激時，NLRP3炎癥小體激活導致caspase-1的成熟[13-14]，活化的caspase-1再激活下游 IL-1β和IL-18前體，同時切割GSDMD膜蛋白[15-16]，使細胞膜破裂，引起炎癥因子(IL-1β、 IL-18)和溶酶體等細胞內容物釋放，從而導致炎癥級聯反應[17]。總的來說，NLRP3的激活導致caspase-1的成熟[18]，其介導細胞焦亡[19-20]并調節促炎細胞因子如IL-1β和IL-18的切割和成熟[21]。近年來研究證實NLRP3炎癥小體參與腎臟炎性損傷[3]。NLRP3/caspase-1/IL-1β誘導的炎癥反應及其相關的組織損傷是導致慢性梗阻性腎病進展為終末期腎病的重要因素[22]。目前，對細胞焦亡在腎臟炎性損傷中作用的研究尚缺乏。本研究構建了小鼠BOO模型，分析了該模型引起的下尿路梗阻介導的腎臟炎性損傷與細胞焦亡有一定的聯系。由此提示，靶向調控NLRP3-caspase-1-pyroptosis信號通路,可抑制caspase-1介導炎性損傷而拮抗細胞焦亡，從而發揮治療梗阻性腎病的潛力。

EMD638683是一種高選擇性SGK1抑制劑，其響應各種刺激并介導許多細胞信號傳導。在多種疾病中觀察到過量的SGK1表達，包括肺纖維化、糖尿病腎病、腎小球腎炎、梗阻性腎病和肝硬化[7]，且過量的SGK1表達與炎癥反應相關[23]。本研究我們也觀察到梗阻3周小鼠腎臟中SGK1的表達顯著高于正常小鼠，并且SGK1表達主要分布于腎臟腎小管細胞中。SGK1是NLRP3炎癥小體活化的關鍵蛋白[8]，主要通過下調NLRP3炎癥小體激活來起作用。實驗采用醛固酮誘導mRTECs炎癥反應，炎癥相關蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β都顯著增多，同時SGK1的表達也顯著增加。但隨著EMD638683的干預，SGK1的表達被顯著抑制，同時炎癥相關蛋白和GSDMD-N也被顯著抑制，表明EMD638683可能通過抑制NLRP3炎癥小體的重組來抑制caspase-1的活性,阻斷caspase-1切割IL-1β和 GSDMD膜蛋白，提示SGK1通過調控NLRP3炎癥小體活化，而介導腎臟炎癥反應和焦亡引起的腎損傷。

Figure 7. Effect of EMD638683 on NLRP3-caspase-1-pyroptosis signaling pathway in mRTECs detected by Western blot using β-actin as internal reference. Mean±SEM.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsCtr group；▲P<0.05，▲▲P<0.01vsALD group.

圖7 EMD638683對mRTEC中NLRP3-caspase-1-pyroptosis信號通路的影響

Figure 8. Effect of EMD638683 on the secretion of IL-1β protein in mRTECs detected by ELISA. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsCtr group；▲▲P<0.01vsALD group.

圖8 EMD638683對mRTEC細胞IL-1β蛋白分泌的影響

本研究表明，小鼠BOO模型引起下尿路梗阻介導的腎臟炎性損傷，同時也觀察到SGK1的表達顯著增加，細胞實驗中也得到證實，即SGK1與腎臟炎性損傷有密切關系。SGK1抑制劑EMD638683能通過減輕醛固酮誘導的腎臟炎癥反應而達到保護腎臟的作用。EMD638683通過抑制NLRP3-caspase-1-pyroptosis信號通路而減輕醛固酮誘導的腎臟炎癥。