BMP-7/Smads通路參與EndoMT在大鼠HHPH中的作用*

張晶晶， 武垣伶， 黃丹娜， 高 慧， 樓國強， 周卓琳， Lingfang SHI， 王萬鐵△

(溫州醫科大學 1病理生理學教研室, 2附屬第二醫院病理科, 浙江 溫州 325035； 3Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Stanford University Medical School, Stanford, CA 94305-5236， USA)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是常見的慢性疾病之一，世界衛生組織預計，到2030年，COPD將成為全球第3大死因，嚴重影響人民的健康狀況和生活質量[1]。研究表明，COPD的預后與肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)發生與否有關[2]。因此，防止PH的發生發展成為緩解COPD亟需解決的問題。PH發生時其肺血管壓力逐漸升高，可導致右心衰竭，甚至死亡。PH持續發展，難以逆轉的主要原因是肺血管重塑(pulmonary vessel structural remodeling，PVSR)。研究表明，肺動脈壁中平滑肌樣細胞大量表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是形成肺血管重塑的重要原因之一[3]。近年來，有研究發現內皮-間充質轉化(endothelial-mesenchymal transition，EndoMT)與PVSR之間有密切關系。Kim等[4]研究發現，內皮細胞(endothelial cells,ECs)可以通過EndoMT使自身α-SMA和波形蛋白等表達上調，從而參與動脈粥樣硬化性血管重塑。但是EndoMT是否參與低氧高二氧化碳性肺動脈高壓(hypoxia-hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH)PVSR的發展及其潛在機制至今尚未完全明確。

目前認為，轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族與EndoMT有著緊密的聯系。骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族屬于TGF-β超家族的成員。有實驗表明，BMP-7與BMP受體(BMP receptor，BMPR)結合后，能激活下游Smad1/5/8，下調膠原蛋白和E-鈣黏蛋白表達水平[5]，也可下調α-SMA蛋白表達水平[6]，從而發揮其抗血管重塑能力。但是目前BMP-7及其下游Smad1/5/8構成的通路對HHPH的影響尚未明確。因此，本文旨在探討BMP-7/Smads通路參與的EndoMT對HHPH的作用以及其可能機制。

材 料 和 方 法

1 細胞、主要試劑和儀器

大鼠肺動脈內皮細胞(rat pulmonary endothelial cells，RPAECs)購自上海拜力生物科技有限公司。BMP受體激動劑rhBMP-7購自PeproTech；BMP受體抑制劑DMH-1購自MedChemExpress；兔抗大鼠p-Smad1/5/8 抗體和兔抗大鼠Smad1/5/8 抗體購自CST；兔抗大鼠α-SMA抗體和小鼠抗大鼠CD31抗體購自Abcam；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和DMEM高糖培養基購自Gibco；RT-PCR引物購自上海捷瑞生物工程有限公司和TaKaRa；TRITC標記山羊抗兔抗體和FITC標記山羊抗小鼠抗體購自博蘊公司；CCK-8試劑盒購自Dojindo；4%多聚甲醛固定液購自碧云天生物技術研究所；逆轉錄試劑盒和BCA 蛋白測定試劑盒購自Thermo。ChemiScope 3600 正置熒光顯微鏡(Nikon)；常氧培養箱和低氧高二氧化碳培養箱(Thermo)；S1000TMPCR熱循環儀和蛋白電泳/轉膜儀(Bio-Rad)；CLINX蛋白曝光儀(上海勤翔科學儀器有限公司)；DYY-5型穩壓穩流電泳儀(北京市六一儀器廠)。

2 主要方法

2.1細胞培養及分組 在5% CO2、21% O2、37 ℃的環境下使用含有10% FBS的DMEM高糖培養基培養RPAECs。細胞生長至匯合時使用0.25%胰蛋白酶傳代，每周傳代2次。參考本研究室前期實驗及其它學者的研究制備細胞模型和確定藥物濃度[7-8]。當RPAECs密度約為80%時，換用無FBS的DMEM高糖培養基處理細胞24 h，隨后隨機分為5組：常氧對照(control, Con)組、低氧高二氧化碳(hypoxia-hypercapnia, HH)組、BMP受體激動劑rhBMP-7組、BMP受體抑制劑DMH-1組和溶劑DMSO組。Con組換新鮮的DMEM高糖培養基，置于常氧培養箱(21% O2、5% CO2)內。HH組換新鮮的DMEM高糖培養基，rhBMP-7組換用含rhBMP-7(100 μg/L)的DMEM高糖培養基，DMH-1組換用含DMH-1(10 μmol/L)和rhBMP-7(100 μg/L)的DMEM高糖培養基，DMSO組換用含DMSO的DMEM高糖培養基(終濃度<0.05%并且與DMH-1組的溶劑濃度一致)，均置于低氧高二氧化碳培養箱(1% O2、6% CO2)內。各組同時培養24 h后收集細胞，進行后續實驗。

2.2CD31和α-SMA免疫熒光雙標法鑒定RPAECs 在6孔板內制備細胞爬片，當細胞狀態良好時進行造模。造模結束后，4%多聚甲醛固定30 min，0.1% Triton X-100處理20 min，5% BSA溶液封閉30 min。滴加1% BSA溶液配制的I抗(含抗α-SMA抗體和抗CD31抗體，稀釋比例均為1 ∶100)，另取一張細胞爬片滴加PBS溶液代替 I 抗作為空白對照，4 ℃冰箱靜置孵育過夜。第2天將爬片取出，避光滴加 II 抗(含TRITC標記 II 抗和FITC標記 II 抗，稀釋比例均為1:100)孵育30 min，滴加DAPI染色液(稀釋比例為1 ∶ 1 000)室溫孵育5 min，滴加防熒光淬滅劑于細胞后封片。在正置熒光顯微鏡下觀察細胞，拍片并保存。

2.3RT-PCR檢測RPAECs中α-SMA、CD31和Smad1/5/8 mRNA的水平 取出造模完畢的RPAECs，加入1 mL TRIzol，用細胞刮研磨細胞，轉移至EP管后冰上裂解10 min。加入200 μL氯仿后顛倒混勻，靜置15 min，離心后吸取上層水相。加入等體積異丙醇，顛倒混勻，離心后收集白色沉淀。加入DEPC水稀釋的75%乙醇，使沉淀懸浮，再次離心收集沉淀即為提取的總RNA。加入20 μL DEPC水溶解RNA沉淀，測定總RNA濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。CD31引物由TaKaRa設計并合成，其余引物由上海捷瑞公司設計并合成，序列見表1。PCR擴增后，產物在恒壓100 V電壓下電泳30～40 min，然后曝光成像。ImageJ軟件分析電泳條帶灰度值，用目的基因與GAPDH基因灰度值之比表示目的基因的表達水平。

2.4Western blot 檢測RPAECs中α-SMA、CD31、Smad1/5/8和p-Smad1/5/8蛋白的水平 用1 mL含PMSF的RIPA裂解液(PMSF∶RIPA=1∶100)裂解造模結束的細胞，充分研磨后轉至EP管中，靜置40 min，離心收集上清。用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白濃度，稀釋成2 g/L后用沸水煮10 min。電泳時每孔蛋白上樣量為20 μg，電泳結束后將蛋白轉膜至PVDF膜，再用10%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1.5 h。洗膜后，4 ℃條件下孵育 I 抗過夜。I 抗α-SMA、CD31、p-Smad1/5/8、Smad1/5/8和GAPDH抗體稀釋比例均為1 ∶ 1 000。第2天洗膜后在室溫下用 II 抗孵育1 h。α-SMA、p-Smad1/5/8、Smad1/5/8、GAPDH蛋白用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 II 抗孵育，CD31蛋白用辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠 II 抗孵育，稀釋比例均為1 ∶ 10 000。 II 抗孵育完畢后，避光滴加ECL化學發光液(溶液A∶溶液B=1 ∶ 1)，曝光并保存條帶。ImageJ軟件分析條帶灰度值，用p-Smad1/5/8與Smad1/5/8蛋白灰度值之比表示p-Smad1/5/8蛋白的表達水平，其余蛋白用目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值之比表示目的蛋白的表達水平。

表1 RT-PCR引物序列

2.5CCK-8法檢測細胞活力 按每孔200 μL的比例在96孔板中接種密度為5×107/L的RPAECs懸液，每組設6個復孔，常規培養。待RPAECs密度約為80%時，制備細胞模型。造模完畢后取出96孔板，棄去舊培養基，滴加PBS溶液洗滌后，向96孔板內含細胞的各孔中滴加10 μL CCK-8和90 μL無血清培養基，置于37 ℃培養箱孵育3 h，然后測定450 nm處的吸光度(A)。結果處理按每組獲得的6個吸光度值，去除一個最大值與一個最小值后進行統計分析。

2.6Transwell小室法檢測細胞遷移情況 用無血清的培養基制備密度為1×108/L的細胞懸液。在Transwell小室的下室分別加入各分組所需的藥物(每孔加500 μL，且含10% FBS)，在上室加200 μL上述細胞懸液，置于培養箱內造模(省略細胞饑餓步驟)。約20 h后取出小室，棄去舊培養基。用干凈棉簽拭去Transwell小室未穿膜的細胞，4%多聚甲醛固定穿膜細胞30 min，PBS漂洗，自然干燥5 min。用結晶紫染液染穿膜細胞30 min，再用PBS溶液清洗數次，室溫下自然風干。用手術刀割下完整的Transwell小室膜，置于載玻片上，蓋上蓋玻片封片。普通顯微鏡下觀察并拍片，計數穿膜細胞數。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件對各組實驗結果進行統計分析。實驗結果用均數±標準差(mean±SD)表示。多組樣本組間比較均數采用單因素方差分析(one-way ANOVA)法，先檢驗方差齊性，若方差齊則兩組間比較采用SNK-q檢驗，若方差不齊則使用Dunnett T3檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組細胞CD31和α-SMA的表達情況

本實驗標記CD31表達的熒光呈綠色，標記α-SMA表達的熒光呈紅色，熒光強度表示蛋白質表達水平。結果顯示，Con組CD31熒光強度高，表達量多，而α-SMA熒光強度弱，幾乎無表達；與Con組相比，HH組細胞CD31熒光強度減弱(P<0.05)，而α-SMA熒光強度增強(P<0.05)；與HH組相比，DMSO組的CD31和α-SMA熒光強度無明顯差別(P>0.05)，而rhBMP-7組CD31熒光強度增強(P<0.05)，α-SMA熒光強度降低(P<0.05)；與rhBMP-7組相比，DMH-1組CD31熒光強度減弱(P<0.05)，α-SMA熒光強度顯著增強(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Immunofluorescence changes of pulmonary artery endothelial cells in each group (×400). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHH group;△P<0.05vsrhBMP-7 group.

圖1 各組大鼠肺動脈內皮細胞CD31和α-SMA的免疫熒光變化

2 各組細胞α-SMA、CD31和Smad1/5/8的mRNA表達情況

由RT-PCR結果顯示，與Con組相比，HH組α-SMA的mRNA表達水平升高(P<0.05)，CD31和Smad1/5/8的mRNA表達水平降低(P<0.05)；與HH組相比，DMSO組α-SMA、CD31和Smad1/5/8的mRNA表達水平無明顯變化(P>0.05)，而rhBMP-7組α-SMA的mRNA表達水平降低(P<0.05)，CD31和Smad1/5/8的mRNA表達水平升高(P<0.05)；與rhBMP-7組相比，DMH-1組α-SMA 的mRNA水平升高(P<0.05)，Smad1/5/8和CD31的mRNA水平降低(P<0.05)，見圖2。

3 各組細胞α-SMA、CD31和p-Smad1/5/8的蛋白表達情況

由Western blot結果顯示，與Con組相比，HH組α-SMA的蛋白表達水平升高(P<0.05)，CD31和p-Smad1/5/8的蛋白表達水平降低(P<0.05);與HH組相比，DMSO組α-SMA、CD31和p-Smad1/5/8的蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)，而rhBMP-7組α-SMA的蛋白表達水平降低(P<0.05)，CD31和p-Smad1/5/8的蛋白表達水平升高(P<0.05);與rhBMP-7組相比，DMH-1組α-SMA的蛋白表達水平升高(P<0.05)，CD31和p-Smad1/5/8的蛋白表達水平降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 2. The mRNA expression levels of α-SMA, CD31 and Smad1/5/8 in each group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHH group;△P<0.05vsrhBMP-7 group.

圖2 各組細胞α-SMA、CD31和Smad1/5/8 mRNA的表達水平

Figure 3. The protein levels of α-SMA, CD31 and p-Smad1/5/8 in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHH group;△P<0.05vsrhBMP-7 group.

圖3 各組α-SMA、CD31和p-Smad1/5/8蛋白的表達水平

4 各組細胞活力的情況

由CCK-8結果顯示，Con組的A值為1.519±0.038，與Con組相比，HH組的A值(1.204±0.085)減小(P<0.05)；DMSO組的A值(1.268±0.044)與HH組相比，差異無統計學顯著性(P>0.05)，而rhBMP-7組A值(1.448±0.012)增大(P<0.05)；與rhBMP-7組相比，DMH-1組A值(0.928±0.012)減小(P<0.05)，見圖4。

5 各組細胞的遷移情況

Transwell實驗結果顯示，與Con組的細胞遷移數相比，HH組遷移細胞數增多(P<0.05)；與HH組相比，DMSO組遷移細胞數差異無統計學顯著性(P>0.05)，而rhBMP-7組的遷移細胞數減少(P<0.05)；與rhBMP-7組相比，DMH-1組遷移細胞數增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 4. The viability of RPAECs in each group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHH group;△P<0.05vsrhBMP-7 group.

圖4 各組大鼠肺動脈內皮細胞活力的變化

討 論

肺動脈高壓的發生并非罕見，目前估計，PH患病率約占全球人口的1%，而年齡超過65歲的人群則高達10%[9]。低氧是PH常見的誘導因素，而且PH的發生常常能引起機體CO2潴留，因此我們使用低O2和高CO2混合氣體條件下的細胞模型更符合臨床PH患者發病特點。肺動脈高壓發展的主要病理變化是PVSR，PVSR發生過程中，前期肺血管內皮細胞功能異常[10]，后期遠端血管肌化增加，表達α-SMA的細胞大量積聚，并延伸到先前未肌化的血管中，從而引起嚴重的肺血管系統結構改變[11-12]。近年的報道發現，ECs通過EndoMT可以表達α-SMA、波形蛋白和成纖維細胞特異蛋白1等，成為研究心肌纖維化、腎纖維化等具有血管重塑特點疾病的熱點[13]。但EndoMT是否參與HHPH及其潛在的機制尚未完全明確。

Figure 5. The migration ability of RPAECs in each group. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHH group;△P<0.05vsrhBMP-7 group.

圖5 各組大鼠肺動脈內皮細胞的遷移情況

EndoMT是指ECs降低CD31和E-鈣黏蛋白等ECs特異性標志物表達水平，而上調α-SMA、成纖維細胞特異蛋白1和波形蛋白等間充質細胞特異性標志物表達水平的過程。ECs形態從鋪路石樣結構逐漸轉變為長梭形結構，且增殖和遷移能力也將改變[14-15]。在EndoMT過程中，ECs可同時存在內皮細胞和間充質細胞的2種特征。因此，抑制EndoMT可能成為治療HHPH的新靶點。

目前認為TGF-β家族與EndoMT發生發展有密切關系。BMPs是TGF-β家族中的成員，主要是介導間充質細胞分化為軟骨和骨形成細胞。BMP-7又稱成骨蛋白1(osteogenic protein-1，OP-1)，近年來，發現其具有抗血管重塑作用而逐漸成為研究熱點[16]。Wang等[17]研究發現，小鼠miR-4739過表達可誘導胸膜纖維化，給予外源性BMP-7后，E-鈣黏蛋白啟動子活性以及mRNA水平下調從而能預防小鼠胸膜纖維化。Higgins等[18]發現，外源性rhBMP-7能抑制膠原蛋白Ⅰα1和膠原Ⅲα1基因表達和膠原蛋白Ⅰ蛋白的積累，同時增加單側輸尿管阻塞模型中腎臟膠原蛋白Ⅳα1的表達。BMPR是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，BMPⅠ型(BMPRⅠa和BMPRⅠb)和Ⅱ型(BMPRⅡ)受體以穩定的同源以及瞬時異聚體受體復合物的形式存在[19-21]。Smads蛋白是BMPR下游關鍵的信號因子，與BMPR有關的Smad因子主要是受體激活的Smads。當BMP-7與BMPR結合后，可以激活Smad1/5/8，再與共同的配體Smad4構成復合物，然后易位到細胞核中誘導相關靶基因轉錄[22]。

本實驗結果顯示，與Con組相比，HH組RPAECs的α-SMA蛋白和mRNA的表達增多，CD31蛋白和mRNA的表達量降低，細胞活力降低而遷移增多，說明低氧高CO2誘導RPAECs發生了EndoMT；DMSO組與HH組相比，各組檢測指標變化無統計學顯著性，說明本實驗中溶劑DMSO對RPAECs無明顯影響；與HH組比較，我們發現使用外源性rhBMP-7激活BMPR后，可出現Smad1/5/8的mRNA表達水平升高，Smad1/5/8的蛋白磷酸化增多，α-SMA 的mRNA和蛋白表達量減少，CD31的mRNA和蛋白表達量升高， RPAECs的活力升高而遷移減少，提示BMP-7/Smads通路激活可以緩解肺血管重塑，從而緩解PH。而DMH-1組與rhBMP-7組相比，DMH-1抑制了BMPR，出現了相反的變化，提示抑制BMP-7/Smads通路將加重肺血管重塑，促進PH的發展。

綜上所述，低氧高二氧化碳環境可以誘導大鼠肺動脈內皮細胞發生EndoMT，促進PH的發展，其機制可能與BMP-7/Smads通路被抑制有關。